周曉晴,胡立文,羅 琦,曾林暉,李 晴,蘭 偉

(1.江西省食品檢驗(yàn)檢測研究院,江西南昌,330001;2.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌,330000;3.江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測院,江西南昌,330000)

茶葉籽油是以茶葉樹(CamelliaSinensisO.Ktze.)的果實(shí)茶葉籽為原料,經(jīng)物理壓榨或溶劑浸出而得的食用油脂,富含不飽和脂肪酸[1]。世界各茶葉產(chǎn)地均對(duì)茶葉籽油進(jìn)行研究和開發(fā)[2-4],中國衛(wèi)生部2009年第18號(hào)文件批準(zhǔn)茶葉籽油為新資源食品。

茶多酚是以茶葉為原料提取的多酚混合物,由黃酮、黃烷酮、酚酸、花青素等組成,其中兒茶素占60%～80%,兒茶素類有八種結(jié)構(gòu),分別是兒茶素(catechin,+C)、表兒茶素(epicatechin,-EC)、兒茶素沒食子酸酯(catechin gallate,-GC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin,-ECG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,-EGC)、表沒食子兒茶素表沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,-EGCG)、沒食子兒茶素(gallocatechin,+GC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate,-GCG),其中-GC、-ECG、-EGCG和-GCG具有酯鍵結(jié)構(gòu)可微溶于油脂[5]。茶多酚可清除自由基,具有抗氧化作用[6]。有研究表明茶多酚可抗結(jié)腸癌[7]。

茶多酚中部分成分可微溶于油脂。有報(bào)道在橄欖油和油茶(CamelliaoleiferaAbel.)油中測得兒茶素[8-9];梁杏秋等[10]認(rèn)為茶多酚酯型化合物以穩(wěn)定狀態(tài)分散地存在于茶葉籽油中。朱晉萱等[11-12]參照GB/T 8313-2018中福林酚法測定了13個(gè)省的茶葉籽油中茶多酚含量,以EGCG為標(biāo)準(zhǔn)物,測得茶多酚含量為19.73～47.61 mg·kg-1。Fazel等[13]以高效液相色譜法(HPLC)測得伊朗地區(qū)茶葉籽油中+C、-EC、-ECG、-EGC、-EGCG、+GC和-GCG 7種兒茶素的含量,其中-GC未檢出;Wang等[14]以高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測得中國多個(gè)產(chǎn)地的茶油、紅花茶油和茶葉籽油中苯甲酸、肉桂酸、羥基苯乙酸、黃烷醇、黃酮醇、黃酮類化合物和二氫黃酮類化合物含量,其中茶葉籽油兒茶素總含量為2.25～3.31 mg·kg-1。上述文獻(xiàn)報(bào)道福林酚法測得茶葉籽油中茶多酚含量,按占比60%～80%換算成兒茶素,與HPLC法測得茶葉籽油中兒茶素類總含量相差較大。

本文參照GB/T 31740.2-2015茶制品中茶多酚和兒茶素測定方法,分別對(duì)茶葉籽壓榨毛油、浸出毛油、粗脂肪和茶葉籽精煉油中茶多酚和兒茶素類進(jìn)行測定,并進(jìn)行分析對(duì)比,探討福林酚法測定茶葉籽油中茶多酚含量和HPLC法測定茶葉籽油中兒茶素總含量的合理性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉籽 采摘自江西萍鄉(xiāng)、興國和婺源;茶葉籽毛油及精煉油 江西信江特種農(nóng)副產(chǎn)品開發(fā)有限公司;甲醇、乙腈 色譜純,西隴科學(xué)有限公司;C標(biāo)準(zhǔn)品、EC標(biāo)準(zhǔn)品、ECG標(biāo)準(zhǔn)品、EGC標(biāo)準(zhǔn)品、EGCG標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥99%,上海源葉生物科技有限公司;茶多酚對(duì)照品 純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;沒食子酸一水合物 阿拉丁試劑;丁基羥基茴香醚(BHA) 食品級(jí),法國丹尼斯克;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT) 食品級(jí),德國洋櫻集團(tuán)有限公司;叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ) 食品級(jí),河南弘成食品添加劑有限公司;維生素E 阿拉丁試劑。

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;Agilent Technologies 1260高效液相色譜儀 美國 Agilent公司;ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6×250 mm 5-Micron) 美國 Agilent公司;752S分光光度計(jì) 上海精若科學(xué)儀器公司;飛鴿TGL-15B高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;AZ-B301榨油機(jī) 青島澳柯瑪生活電器有限公司;NAI-ZFCDY-6Z脂肪測定儀 上海那艾精密儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶葉籽油制備

1.2.1.1 壓榨毛油制備 將茶葉籽去殼,稱取4 kg茶葉籽仁,粉碎篩分得到60目的茶葉籽仁粉,并在900 W和80 ℃下微波處理80 s,用榨油機(jī)壓榨得到壓榨茶葉籽毛油,稱重,備用。

1.2.1.2 浸出毛油制備 將茶葉籽去殼,稱取2 kg茶葉籽仁,粉碎篩分得到60目的茶葉籽仁粉,并在900 W和80 ℃下微波處理80 s,置于燒瓶中,加入石油醚浸出,料液比(w/v)1∶4,浸泡24 h,每隔3 h攪拌1次,分離浸出液;再次以料液比(w/v)1∶2加入石油醚浸出,操作同上,分離并合并兩次浸出液,以0.09 MPa 40 ℃旋蒸回收石油醚,旋蒸至冷凝管無液滴流下,得到浸出茶葉籽毛油,稱重,備用。

1.2.1.3 茶葉籽粗脂肪制備 將茶葉籽去殼,稱取2 kg茶葉籽仁,粉碎篩分得到60目的茶葉籽仁粉,將20 g茶葉籽仁粉加入濾紙筒內(nèi),用脂肪測定儀提取粗脂肪,收集提取液,以0.09 MPa 40 ℃旋蒸回收石油醚,旋蒸至冷凝管無液滴流下,得到粗脂肪,稱重,備用。

1.2.2 提取茶多酚

1.2.2.1 提取油脂中茶多酚 取壓榨毛油、浸出毛油、茶葉籽粗脂肪、廠家提供毛油和精煉油各100 g,分別置于500 mL具塞三角瓶中,加入120 mL正己烷,充分振搖3 min,再加70%的甲醇溶液20 mL,充分振搖5 min,轉(zhuǎn)移至500 mL分液漏斗中靜置20 min,分液;再向上層液加入70%的甲醇溶液20 mL,重復(fù)提取一次,合并兩次下層提取液,以0.09 MPa 72 ℃旋蒸濃縮至約1 mL,收集濃縮液,并用甲醇定容至2 mL,過膜,用于HPLC法測定。

取壓榨毛油、浸出毛油、茶葉籽粗脂肪、廠家提供毛油和精煉油各5 g,分別置于250 mL具塞三角瓶中,加入15 mL正己烷,充分振搖3 min,再加70%的甲醇溶液10 mL,充分振搖5 min,轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中,靜置20 min,分液;再向上層液加入70%的甲醇溶液10 mL,重復(fù)提取一次,合并兩次下層提取液,以0.09 MPa 72 ℃旋蒸濃縮至約1 mL,收集濃縮液,并用甲醇定容至2 mL,用于福林酚法測定。

1.2.2.2 提取茶葉籽殼、仁及油粕中茶多酚 分別取三個(gè)產(chǎn)地茶葉籽的殼、仁、壓榨法所得油粕、浸出法所得油粕和索氏抽提所得脫脂茶葉籽仁粉各5 g,分別置于50 mL離心管中,加入預(yù)熱至70 ℃的70%的甲醇溶液10 mL,于70 ℃水浴鍋中提取10 min,5 min振蕩一次,然后以6000 r/min離心5 min,分離上層清液;重復(fù)上述提取步驟,每個(gè)樣品提取三次,合并提取液[15],過膜,用于HPLC法測定。

分別取三個(gè)產(chǎn)地茶葉籽的殼、仁、壓榨法所得油粕、浸出法所得油粕和索氏抽提所得脫脂茶葉籽仁粉各0.5 g,重復(fù)上一段所述提取操作,合并提取液,用于福林酚法測定。

1.2.3 茶多酚和兒茶素測定

1.2.3.1 福林酚法測茶多酚 參照GB/T 31740.2-2015茶制品第2部分:茶多酚附錄A使用茶多酚做對(duì)照品進(jìn)行測定,將提取的茶多酚樣品與福林酚試劑反應(yīng)1 h,以6000 r/min離心10 min再測定。

1.2.3.2 福林酚法檢出限和精密度 分別配制5～100 μg·mL-1的茶多酚和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作液,按福林酚法測定得到兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線,以扣除空白吸光度值為0.01時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度作檢出限[16]。取10 μg·mL-1的茶多酚和沒食子酸溶液按福林酚法平行測定6次,計(jì)算RSD值。

1.2.3.3 HPLC法測兒茶素類 參照GB/T 31740.2-2015茶制品第2部分:茶多酚附錄B,修改流動(dòng)相梯度洗脫程序,色譜條件如下:

流動(dòng)相A:分別將90 mL乙腈,20 mL冰乙酸,2 mL EDTA-2Na溶液加入1 L定容瓶中,用水定容至刻度,搖勻,過0.45 μm膜;流動(dòng)相B:分別將800 mL乙腈,20 mL冰乙酸,2 mL EDTA-2Na溶液加入1 L定容瓶中,用水定容至刻度,搖勻,過0.45 μm膜;洗脫程序:0～10 min流動(dòng)相A比例100%,10～30 min流動(dòng)相A降至60%,30 min后流動(dòng)相A恢復(fù)至100%,至35 min結(jié)束;流速1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測器:紫外檢測器;檢測波長:278 nm;柱溫:35 ℃。

1.2.3.4 HPLC法檢出限和精密度 將兒茶素類標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至HPLC峰高信號(hào)接近噪音值,以3倍信噪比對(duì)應(yīng)濃度作方法檢出限。取200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液平行測定6次,計(jì)算各兒茶素的RSD值。

1.2.3.5 福林酚法干擾物質(zhì)分析 取維生素E 0.5 g,置于250 mL具塞三角瓶中,加入15 mL正己烷,充分振搖3 min,再加70%的甲醇溶液10 mL,充分振搖5 min,轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中,靜置20 min,分液;再向上層液加入70%的甲醇溶液10 mL,重復(fù)提取一次,合并兩次下層提取液,以0.09 MPa 72 ℃旋蒸濃縮至約1 mL,收集濃縮液,并用甲醇定容至2 mL;配制20 μg·mL-1的BHA、BHT和TBHQ甲醇溶液,按福林酚法測定這4個(gè)樣品的吸光度值。

1.2.4 測定方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 茶多酚精煉油膠體制備 精確稱取0.01 g茶多酚,用乙醇溶解并定容至200 mL,配得0.05 g·L-1的茶多酚乙醇溶液。分別稱取3份100 g茶葉籽精煉油,加熱至75 ℃,分別加入0.05 g·L-1茶多酚乙醇溶液8、12、16 mL,充分?jǐn)嚢韬?放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,以0.09 MPa 72 ℃旋蒸除去乙醇,旋蒸至冷凝管無液滴流下,再旋蒸0.5 h,制得4、6、8 mg·kg-1茶多酚精煉油膠體,將樣品轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中待用。

1.2.4.2 福林酚法和HPLC法重現(xiàn)性 取6份廠家提供的茶葉籽毛油,以福林酚法測茶多酚含量,根據(jù)6份茶葉籽毛油茶多酚含量計(jì)算RSD值。再取6份廠家提供的茶葉籽毛油,以HPLC法測定兒茶素類含量,計(jì)算各兒茶素RSD值。

取5 g茶葉籽精煉油以福林酚法測吸光度值作空白,再分別取6份4、6、8 mg·kg-1茶多酚精煉油膠體,以福林酚法測茶多酚含量,計(jì)算回收率和4、6、8 mg·kg-1茶多酚精煉油膠體的RSD值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),計(jì)算RSD值,用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定方法的線性范圍、檢出限和精密度

2.1.1 福林酚法測茶多酚 由表1得以茶多酚對(duì)照品和沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢出限分別為0.149和0.153 μg·mL-1;RSD值分別為1.19%和0.72%,可知實(shí)驗(yàn)方法精密度較好,符合實(shí)驗(yàn)測定要求。采用茶多酚對(duì)照品所得標(biāo)準(zhǔn)曲線與按照GB/T 31740.2-2015附錄A中采用沒食子酸所得標(biāo)準(zhǔn)曲線不一致,同一樣品吸光度值經(jīng)茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的含量較沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線所得含量更高。本文以茶多酚對(duì)照品所作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算茶多酚含量。

表1 茶多酚的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和精確度Table 1 Liner ranges,liner equations,correlation coefficients,LODs and precision for tea polyphenols determination

2.1.2 HPLC測兒茶素類 按GB/T 31740.2-2015附錄B方法配制10～400 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液,經(jīng)測定得五個(gè)兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,數(shù)據(jù)見表2;可知各兒茶素檢出限和方法精密度符合測定要求。

表2 兒茶素類的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和精確度Table 2 Liner ranges,liner equations,correlation coefficients,LODs and precision for catechins determination

2.2 福林酚法和HPLC法對(duì)比

2.2.1 福林酚法測茶多酚含量和HPLC測兒茶素類總量 從表3測定結(jié)果可知:同一樣品經(jīng)福林酚法測得茶多酚含量和HPLC法測得兒茶素總含量,茶多酚含量大于兒茶素總含量的10倍。福林酚法測定原理是:在堿性條件下,W6+氧化多酚,得到藍(lán)色的W5+,反映茶多酚含量,但易受其他物質(zhì)干擾。HPLC法通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間定性和峰面積定量測定目標(biāo)物質(zhì)及其含量,精確度較福林酚法高。色譜圖如圖1所示。

表3 茶葉籽油、茶葉籽和油粕中茶多酚含量和兒茶素總量Table 3 Contents of tea polyphenols and catechins in tea seed oil,tea seed and oil cakes

圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品(B)色譜圖Fig.1 The chromatography of catechin standard(A)and sample(B)

2.2.2 福林酚法干擾物質(zhì)分析 由表4可知,維生素E、BHA、BHT和TBHQ是含酚羥基的脂溶性物質(zhì),在福林酚法測茶葉籽油中茶多酚時(shí)均可產(chǎn)生干擾。按茶多酚對(duì)照品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算,對(duì)應(yīng)的茶多酚含量為5.877、4.242、4.440和4.889 mg·kg-1。維生素E為油脂伴隨物質(zhì),在測定茶葉籽毛油和精煉油中茶多酚含量時(shí)可產(chǎn)生干擾;BHA、BHT和TBHQ為常用的食用油抗氧化劑,對(duì)測定茶葉籽精煉油中茶多酚含量可產(chǎn)生干擾。油脂中除維生素E外,可能存在其他含酚羥基物質(zhì),因此,以福林酚法測茶葉籽油中茶多酚時(shí),不能排除這些物質(zhì)對(duì)測定結(jié)果的干擾。

表4 福林酚法測得維生素E、BHA、BHT和TBHQ的吸光度值Table 4 Absorbance values of vitamin E,BHA,BHT and TBHQ were measured by Folin phenol method

2.3 兩種方法測定茶多酚含量的重現(xiàn)性

2.3.1 福林酚法測定茶多酚含量的重現(xiàn)性 由表5得RSD值為7.21%,重現(xiàn)性差。GB/T 31740.2-2015附錄A要求樣品提取液與10%福林酚試劑反應(yīng)后室溫靜置1 h后進(jìn)行測定,驗(yàn)證福林酚法穩(wěn)定性,取茶葉籽殼提取液按照福林酚法反應(yīng)后,每10 min測一次吸光度值,反應(yīng)液吸光度值變化如圖2所示,60 min后吸光度值穩(wěn)定,90 min后略微增加;樣品提取液與10%福林酚試劑反應(yīng)后60～90 min內(nèi)能完成一批樣品測定,則各樣品測定先后順序不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和一致性。

表5 福林酚法測茶葉籽毛油茶多酚含量重現(xiàn)性Table 5 Reproducibility of Folin phenol method for determination of tea polyphenols content in tea seed oil

圖2 福林酚法樣品穩(wěn)定性Fig.2 Stability of sample measured by Folin phenol method

2.3.2 HPLC法測定兒茶素類含量的重現(xiàn)性 結(jié)果如表6所示,各兒茶素的RSD值不同,其中EGCG和ECG重現(xiàn)性差,但兒茶素總含量重現(xiàn)性較好,可滿足測定要求。

表6 HPLC法測茶葉籽毛油兒茶素類含量重現(xiàn)性Table 6 Reproducibility of HPLC for determination of catechins content in tea seed oil

2.3.3 以福林酚法測定茶多酚精煉油膠體中茶多酚的回收率和重現(xiàn)性 如圖3所示,1號(hào)樣品是茶多酚精煉油膠體,2號(hào)樣品是茶葉籽精煉油;制備的茶多酚精煉油膠體在一段時(shí)間內(nèi)澄清透明,不產(chǎn)生沉淀,一束光穿過產(chǎn)生丁達(dá)爾效應(yīng),表明茶多酚呈納米級(jí)或準(zhǔn)納米級(jí)晶體均勻分布于茶葉籽精煉油內(nèi)。

圖3 茶多酚精煉油膠體丁達(dá)爾效應(yīng)Fig.3 Tyndall phenomenon of tea polyphenol colloid

用福林酚法測茶多酚精煉油膠體中茶多酚含量,以茶葉籽精煉油作空白,可扣除福林酚法干擾。精煉油膠體中茶多酚的回收率和重現(xiàn)性測定結(jié)果如表7所示,3個(gè)加標(biāo)量平行測定6次的回收率為90.97%～109.00%,可知本實(shí)驗(yàn)預(yù)處理方法和測定方法可信度較好。測定茶多酚精煉油膠體中茶多酚含量重現(xiàn)性較好,3組實(shí)驗(yàn)樣品RSD值均小于3%;與表5福林酚法測茶葉籽毛油中茶多酚含量和表6 HPLC法測茶葉籽毛油中兒茶素類含量數(shù)據(jù)對(duì)比,可知茶葉籽毛油中茶多酚分布不均勻。

表7 福林酚法測茶多酚精煉油膠體中茶多酚含量回收率和重現(xiàn)性Table 7 Reproducibility and recovery rate of Folin phenol method for determination of tea polyphenols content in tea polyphenol colloid

3 結(jié)論

以福林酚法測得茶葉籽毛油中茶多酚含量為16.311～27.596 mg·kg-1,按60%～80%計(jì)算所含兒茶素總含量,遠(yuǎn)超HPLC法測得兒茶素總含量0.627～1.639 mg·kg-1。茶葉籽油中維生素E和帶有酚羥基的油脂抗氧化劑對(duì)福林酚法測油脂中茶多酚產(chǎn)生干擾,因此,福林酚法不適用于測定油脂中茶多酚含量。

以福林酚法測茶葉籽毛油中茶多酚含量重現(xiàn)性較差;HPLC法測茶葉籽毛油中單一兒茶素重現(xiàn)性差,但測兒茶素總含量重現(xiàn)性較好。用福林酚法測精煉油膠體茶多酚含量,因茶多酚分布均勻,重現(xiàn)性較HPLC法測兒茶素總含量更好?；厥章蕦?shí)驗(yàn)中,三組實(shí)驗(yàn)樣品回收率為90.97%～109.00%,可知本實(shí)驗(yàn)中預(yù)處理方法和測定方法可信度較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明茶葉籽毛油中茶多酚能以相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)存在,但分布不均勻。