2 張素勤2

(1.貴州大學農(nóng)學院， 貴陽 550025； 2.國家小麥改良中心貴州分中心， 貴州 貴陽550025)

山羊草屬(Aegilops)植物主要分布于小亞細亞、巴基斯坦、地中海和中亞，現(xiàn)在歐洲、非洲大陸、地中海沿岸、帕米爾高原和中亞西亞廣為分布[1]。普通小麥(TriticumaestivumL.)由3個染色體組組成，其中B和D 2個染色體組來源于山羊草屬，山羊草屬與小麥屬(Triticum)的親緣關系最近，山羊草屬幾乎所有的種均可與小麥雜交[2]。山羊草屬含有許多對改造栽培小麥品質(zhì)及農(nóng)藝性狀十分有價值的基因，例如抗葉銹病、條銹病、赤霉病、白粉病及眼斑病、早熟、抗倒伏、抗蟲害、抗寒、抗旱、高蛋白質(zhì)等優(yōu)異基因，是小麥改良的1個豐富基因庫，在小麥進化中起著重要作用[2-3]。小傘山羊草(Aegilopsumbellulata，UU，2 n=2 x=14)是山羊草屬二倍體物種，該物種的U基因組是小麥和相關物種的幾個基本基因組之一[4-6]。充分發(fā)掘、利用小傘山羊草的優(yōu)良基因，通過遠緣雜交技術(shù)導入小麥對提高栽培小麥品質(zhì)與抗性等具有重要意義。

熒光原位雜交(Fluorescence in Situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是遠緣雜種鑒定、異源多倍體起源及進化等相關研究的有力工具[7]。通過DNA重復序列可以用于染色體辨別、基因組組成及進化分析，外源遺傳物質(zhì)檢測等多項研究[8]。Adonina 等[9]對擬斯卑爾脫山羊草(Aegilopsspeltoides)雜交后代的染色體組進行了FISH核型分析。Schneider[10]等采用pAs 1和pSc 119.2探針對小麥-山羊草附加系的染色體進行了FISH鑒定。Tang等[11-12]開發(fā)出的寡核苷酸Oligo-pSc 119.2-1與Oligo-pTa-535-1探針可以作為有效區(qū)分小麥及其遠緣物種的染色體。宮文萍等[13]用Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1和(GAA)8為探針的FISH分別對小麥-單芒山羊草雙二倍體和中國春-單芒山羊草附加系進行了分析，并建立了其FISH核型。董磊等[14]利用Oligo-pTa 535和Oligo-pSc 119. 2探針對多份擬斯卑爾脫山羊草進行FISH分析，準確區(qū)分擬斯卑爾脫山羊草的不同染色體，建立了擬斯卑爾脫山羊草的FISH核型。本試驗以寡核苷酸Oligo-pSc 119.2-1與(GAA)7重復序列為探針的雙色FISH技術(shù)對小傘山羊草根尖細胞染色體進行核型分析，以期得到小傘山羊草的FISH核型，為小麥遺傳研究及新品種培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為小傘山羊草(Aegilopsumbellulata，UU，2 n=2 x=14)，具有早熟、耐逆，抗銹病、白粉病，抗蚜蟲等優(yōu)點，保存于國家小麥改良中心貴州分中心實驗室。

1.2 染色體制片

將種子置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中于常溫下發(fā)芽，待根長至2 cm左右時，剪取根尖用N2O處理2 h，在90%冰醋酸中固定10 min，用蒸餾水沖洗3遍后切取根尖分生區(qū)置于37 ℃水浴酶解50 min，用70%酒精沖洗3遍，搗碎根尖后加入冰醋酸滴片，在顯微鏡(OLMPUS BX 60)下鏡檢，選取分裂相好的片子保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 熒光原位雜交分析

FISH技術(shù)參照Han等[15]的方法，小傘山羊草的染色體命名參照Friebe等[6]和Mirzaghaderi等[16]的方法。Oligo-pSc 119.2-1(綠色)與(GAA)7(紅色)探針由Thermo Fisher Scientific(上海)公司合成。選擇FISH效果好的細胞用Cellsens Standard攝像系統(tǒng)照相。選取5個分裂相好且染色清晰的細胞用于FISH核型分析，以得到準確可靠的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

本試驗分別以Oligo-pSc 119.2-1(綠色)與(GAA)7(紅色)重復序列為探針對小傘山羊草根尖細胞染色體進行了FISH分析(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小傘山羊草共包含7對染色體，其中1 U和5 U染色體各含有1對隨體。Oligo-pSc-119.2-1信號主要分布在染色體的端部與近端部，不同染色體之間的信號強度有所差別。(GAA)7信號較Oligo-pSc 119.2-1的亮度高，而且分布更豐富，許多染色體著絲點附近(GAA)7信號尤其強烈。

注：Oligo-pSc 119.2-1探針為綠色，(GAA)7探針為紅色；背景染色體由DAPI復染為藍色；比例尺為10 μm。圖1 小傘山羊草根尖細胞染色體的FISH核型

小傘山羊草1 U染色體兩端部具有清晰的Oligo-pSc 119.2-1綠色信號(圖2)；著絲點處有(GAA)7紅色信號。2 U染色體上Oligo-pSc 119.2-1信號位于染色體兩端部；(GAA)7信號則位于著絲點處、長臂中間與端部。3 U染色體上信號豐富，明亮的Oligo-pSc 119.2-1信號位于染色體兩端部；(GAA)7信號處于著絲點附近、長臂中間與近端部。4 U染色體上Oligo-pSc 119.2-1信號位于染色體兩端部；(GAA)7信號較豐富，主要分布在著絲點處，短臂中間及端部。5 U染色體在著絲點與長臂近端部有(GAA)7信號。6 U染色體上(GAA)7信號位于染色體著絲點、長臂端部、短臂近端部，其中長臂端部信號最為明亮；Oligo-pSc 119.2-1信號只有1對，因與長臂端部(GAA)7強信號重疊而不易辨認。7 U染色體上存在較多的Oligo-pSc 119.2-1與(GAA)7信號，其中Oligo-pSc 119.2-1信號位于長臂中間與短臂端部；(GAA)7信號分別分布在著絲點處、長臂中間及短臂端部。

圖2 小傘山羊草U基因組的FISH核型

Oligo-pSc 119.2-1信號主要分布在小傘山羊草染色體兩端部，表明該U基因組的端部常含有pSc119.2重復序列。因為小傘山羊草的一些(如1 U、2 U、3 U和4 U)染色體的Oligo-pSc 119.2-1信號具有相似性，所以只采用Oligo-pSc 119.2-1探針的單色FISH不能鑒別所有染色體。將Oligo-pSc-119.2-1與(GAA)72種探針配合使用可以有效地鑒別每一染色體。

3 討 論

小麥遠緣雜交可將野生植物的基因?qū)胄←溨校S富小麥的基因庫，以創(chuàng)造出新的小麥種質(zhì)資源及優(yōu)良小麥新品種[17]。小麥遠緣雜交是染色體工程的基礎，而山羊草屬是小麥遠緣雜交的重要材料，小麥與山羊草屬遠緣雜交可獲得小麥新資源。Mirzaghaderi等采用pSc 119.2探針對小傘山羊草進行了FISH核型分析，發(fā)現(xiàn)pSc 119.2信號主要分布于染色體端部[16]。本試驗利用Oligo-pSc-119.2-1探針對小傘山羊草進行了FISH分析，也發(fā)現(xiàn)Oligo-pSc-119.2-1信號主要分布在染色體的端部，獲得了與Mirzaghaderi等[16]相似的結(jié)果；但是5 U和6 U染色體上Oligo-pSc-119.2-1信號存在差別，可能是試驗材料不同的緣故。

小麥中GAA-衛(wèi)星序列的雜交模式與N帶模式相同[18]，N帶模式與C帶基本相同[19]。Friebe等[6]對小傘山羊草進行C-帶帶型分析，發(fā)現(xiàn)在染色體著絲粒處都存在C-帶，其余分布在端部，臂中間部位的C-帶較少。本試驗小傘山羊草(GAA)7信號與Friebe等[6]建立的C-帶核型圖有相似性，但也有一些不同，如2 U、3 U、4 U和 7 U染色體的(GAA)7信號與C-帶都分布較廣，在染色體臂與著絲點處都存在；而1 U和5 U染色體的(GAA)7信號則較C-帶少，其原因是C帶技術(shù)主要顯示染色體上的異染色質(zhì)，其含有大量豐富的高度重復的DNA順序，而(GAA)7只是1種DNA重復序列。小傘山羊草FISH核型與C-帶核型圖相比，探針信號與染色體背景反差大、條帶豐富、視覺效果明顯好于C-帶核型，有效提高了染色體核型分析的效果[14]。

本試驗Oligo-pSc-119.2-1信號主要分布在小傘山羊草染色體的端部與近端部。(GAA)7信號主要集中于染色體著絲點與近著絲點處，不但比Oligo-pSc-119.2-1信號的亮度強，分布豐富，而且在染色體上的分布可與Oligo-pSc-119.2-1信號互補。因此將Oligo-pSc-119.2-1與(GAA)72種探針配合使用以準確地辨別小傘山羊草的所有染色體，建立了小傘山羊草的FISH核型，可為小麥遺傳育種提供參考。