許 娜， 蔡興坤， 田 梅， 謝國(guó)勇， 秦民堅(jiān)

(中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院 中藥資源系， 江蘇 南京 211198)

射干〔Belamcandachinensis(Linn.) Redouté〕隸屬于鳶尾科(Iridaceae)射干屬(BelamcandaAdans.)，為多年生草本植物，廣泛分布于中國(guó)各地，生于林緣或山坡草地，大部分生于海拔較低的地方，但在西南山區(qū)可生長(zhǎng)于海拔2 000～2 200 m區(qū)域。射干具有良好的觀賞價(jià)值[1]和明確的藥理作用(如抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等)[2-5]。近年來(lái)，關(guān)于射干化學(xué)成分分析[6-7]、藥理作用[8]和臨床應(yīng)用[9]等方面的研究報(bào)道較多，而關(guān)于其生物學(xué)方面的研究報(bào)道卻相對(duì)較少[10-12]，尤其是關(guān)于其開花和傳粉生物學(xué)特性方面的研究報(bào)道更少[10，13]。明確射干的開花特性和繁育系統(tǒng)，不但有助于深入了解射干的個(gè)體發(fā)育規(guī)律，而且能夠?yàn)樯涓傻目沙掷m(xù)利用和資源保護(hù)等工作提供可靠的數(shù)據(jù)資料和理論依據(jù)，對(duì)射干雜交育種工作的開展以及提高射干的繁殖效率、藥材產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。

鑒于此，作者對(duì)射干的花部特征、開花進(jìn)程、花粉活力、柱頭可授性、繁育系統(tǒng)類型、泌蜜日節(jié)律及訪花昆蟲的傳粉行為進(jìn)行了研究，以期揭示射干花器官對(duì)蟲媒異花傳粉的適應(yīng)機(jī)制，為射干的人工栽培管理和新品種繁育等提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

以中國(guó)藥科大學(xué)藥用植物園種質(zhì)資源圃內(nèi)人工種植5 a的射干居群為研究對(duì)象，居群面積約150 m2，共有射干植株850余株。該種質(zhì)資源圃地理坐標(biāo)為北緯32°54′37″、東經(jīng)118°54′39″，海拔12 m，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫15.7 ℃，年平均降水量1 072.9 mm，年平均日照時(shí)數(shù)2 017.2 h；土壤類型主要為紅棕壤。

1.2 方法

1.2.1 花部特征及開花進(jìn)程觀測(cè) 在2018年6月10日，采用五點(diǎn)取樣法劃分5個(gè)面積3 m×3 m的樣方，對(duì)樣方內(nèi)所有射干植株的花進(jìn)行仔細(xì)觀察，記錄該居群的花期、單株花期(從第1朵花開放至最后1朵花閉合的天數(shù))和單花花期(從花瓣開始展開至卷曲閉合的時(shí)長(zhǎng))。按照以下標(biāo)準(zhǔn)確定開花進(jìn)程，以樣方內(nèi)10%的射干植株同時(shí)開花為始花期，樣方內(nèi)超過50%的射干植株同時(shí)開花為盛花期，樣方內(nèi)僅10%以內(nèi)的射干植株仍在開花為末花期。隨機(jī)選取20株射干植株，每株選取3枚花，使用游標(biāo)卡尺(精度0.02 mm)測(cè)量花冠直徑、外輪花被片的長(zhǎng)度和寬度、內(nèi)輪花被片的長(zhǎng)度和寬度、子房長(zhǎng)度、雌蕊長(zhǎng)度及雄蕊長(zhǎng)度。

選取3個(gè)即將開放的花蕾，采用常規(guī)石蠟切片法[14]54-63制片，分別對(duì)石蠟包埋塊進(jìn)行橫切和縱切，切片厚度8 μm，經(jīng)PAS法[14]85-86染色后，使用Eclipse E200光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)觀察蜜腺的位置。取射干花瓣基部的蜜腺組織，取樣面積1 mm×1 mm，參照李和平[15]的方法依次進(jìn)行戊二醛固定、鋨酸固定、乙醇脫水、乙酸異戊酯替換和干燥，使用導(dǎo)電膠帶將干燥后的樣品固定在掃描電子顯微鏡的載物臺(tái)上，使用SU8010型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)對(duì)樣品進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.2 花粉活力及柱頭可授性檢測(cè) 采用MTT染色法[16]檢測(cè)花粉活力。在2018年6月11日，隨機(jī)選取21個(gè)次日開放的花蕾，套袋；在開花當(dāng)天7：00至19：00，每2 h采集1次花粉，每次選取3枚花，經(jīng)MTT溶液染色5 min后觀察花粉粒的著色狀況，根據(jù)花粉粒著色狀況判斷花粉活力，花粉粒變?yōu)樗{(lán)紫色表示有活力。每枚花視為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀察3個(gè)視野。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算花粉活力，計(jì)算公式為花粉活力=(視野內(nèi)染色花粉粒數(shù)/視野內(nèi)花粉?？倲?shù))×100%。

采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法[17]檢測(cè)柱頭可授性。在2018年6月12日7：00至19：00，每2 h取1次柱頭，每次選取5枚盛開的花，共選取35枚花。先使用NSZ-608T體視顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)對(duì)柱頭上腺毛的發(fā)育狀況進(jìn)行觀察和拍照，再將柱頭浸入聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液〔V(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%聯(lián)苯胺)∶V(體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫)∶V(蒸餾水)=4∶11∶22〕中，根據(jù)柱頭染色程度及氣泡產(chǎn)生速率判斷柱頭的可授性。

1.2.3 雜交指數(shù)計(jì)算 在2018年6月23日11：00至15：00，隨機(jī)選取30枚盛開的花，測(cè)量其花冠直徑，按照Dafni[18]的方法計(jì)算雜交指數(shù)(OCI)，并判斷射干的繁育系統(tǒng)類型?；ü谥睆叫∮诘扔?.00 mm，記為“0”；花冠直徑大于1.00 mm、小于等于2.00 mm，記為“1”；花冠直徑大于2.00 mm、小于等于6.00 mm，記為“2”；花冠直徑大于6.00 mm，記為“3”。雄蕊與雌蕊同時(shí)成熟或雌蕊先熟，記為“0”；雄蕊先熟，記為“1”。柱頭與花藥等高，記為“0”；柱頭與花藥在空間上分離，記為“1”。上述3個(gè)指標(biāo)之和即為OCI值。OCI值為0，表示繁育系統(tǒng)為閉花受精；OCI值為1，表示繁育系統(tǒng)為專性自交；OCI值為2，表示繁育系統(tǒng)為兼性自交；OCI值為3，表示繁育系統(tǒng)為自交親和，有時(shí)需要傳粉者；OCI值大于等于4，表示繁育系統(tǒng)以異交為主，需要傳粉者，并存在部分自交親和。

1.2.4 花粉/胚珠比統(tǒng)計(jì) 在2018年6月24日，隨機(jī)選取30個(gè)次日開放且蕾長(zhǎng)基本一致的花蕾，每個(gè)花蕾隨機(jī)選取1枚雄蕊，置于1 mol·L-1HCl溶液中，于60 ℃水浴水解1 h；用蒸餾水將花粉懸浮液定容至10 mL，置于XW-80A旋渦混合器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)中振蕩均勻；取10 μL均勻的花粉懸浮液，置于潔凈的載玻片上，在Eclipse E200光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)10 μL花粉懸浮液中的花粉粒數(shù)，計(jì)算平均花粉粒數(shù)(P)，計(jì)算公式為P=〔(∑n)/30〕×100，其中，n為10 μL花粉懸浮液中的花粉粒數(shù)。

用解剖刀剖開上述花的子房，統(tǒng)計(jì)子房?jī)?nèi)的胚珠數(shù)，計(jì)算平均胚珠數(shù)(O)，計(jì)算公式為O=(∑m)/30，其中，m為子房?jī)?nèi)的胚珠數(shù)。

根據(jù)花粉粒數(shù)和胚珠數(shù)計(jì)算花粉/胚珠比(P/O)，計(jì)算公式為P/O=平均花粉粒數(shù)/平均胚珠數(shù)。根據(jù)Cruden[19]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，P/O值為2.7～5.4，表示繁育系統(tǒng)為閉花受精；P/O值為18.1～39.0，表示繁育系統(tǒng)為專性自交；P/O值為31.9～396.0，表示繁育系統(tǒng)為兼性自交；P/O值為244.7～2 588.0，表示繁育系統(tǒng)為兼性異交；P/O值為2 108.0～195 525.0，表示繁育系統(tǒng)為專性異交。

1.2.5 授粉試驗(yàn) 在2018年6月28日至7月2日，隨機(jī)選取270個(gè)即將開放且發(fā)育正常的花蕾，平均分成9組，分別掛牌并做好標(biāo)記。在開花前一天17：00至19：00分別對(duì)9組花蕾進(jìn)行不同的授粉試驗(yàn)。其中，T1組花蕾直接套袋；T2組花蕾去雄蕊后套袋；T3組花蕾剝?nèi)?枚完整的外輪花被片后套袋，次日除袋后自然授粉；T4組花蕾剝?nèi)?枚外輪花被片但保留蜜道后套袋，次日除袋后自然授粉；T5組花蕾剝?nèi)ト炕ū黄筇状?，次日除袋后自然授粉；T6組花蕾剝?nèi)バ廴锖筇状?，次?：00至11：00自花授粉；T7組花蕾剝?nèi)バ廴锖筇状?，次?：00至11：00同株異花授粉；T8組花蕾剝?nèi)バ廴锖筇状?，次?：00至11：00異株授粉；T9組花蕾直接套袋，次日除袋后自然授粉，以此組為對(duì)照組(CK)。在授粉14 d統(tǒng)計(jì)各組的坐果率、種子數(shù)和結(jié)籽率，計(jì)算公式分別為坐果率=(某組的結(jié)果總數(shù)/30)×100%；種子數(shù)=某組所有果實(shí)的種子總數(shù)/該組結(jié)果總數(shù)；結(jié)籽率=某組所有果實(shí)結(jié)籽率的總和/該組的結(jié)果總數(shù)。

1.2.6 泌蜜量和花蜜含糖量測(cè)定 在2018年6月27日，隨機(jī)選取30個(gè)次日開放且蕾長(zhǎng)基本一致的花蕾，分別掛牌并做好標(biāo)記，使用40目網(wǎng)袋套袋。在開花當(dāng)天7：00至19：00，每2 h用內(nèi)徑0.2 mm硬質(zhì)毛細(xì)玻璃管吸取并測(cè)定泌蜜量，用游標(biāo)卡尺測(cè)量毛細(xì)玻璃管中蜜柱高度(h)，計(jì)算單花日泌蜜量(v)，計(jì)算公式為v=πr2h，式中，r為毛細(xì)玻璃管的內(nèi)半徑。使用MASTER-500手持式旋光測(cè)糖儀(ATAGO中國(guó)分公司)測(cè)定花蜜含糖量，并記錄測(cè)量時(shí)地表的溫度和濕度。

1.2.7 訪花昆蟲及傳粉行為觀察 在2018年7月13日至15日，參考Totland等[20]的方法連續(xù)3 d觀察昆蟲的訪花情況。在居群中劃分面積5 m×5 m的樣方，在每天7：00至17：00，每2 h觀察并記錄1次樣方內(nèi)訪花昆蟲的種類、數(shù)量、單次訪花時(shí)間和單花訪問頻率，每次觀察10 min。拍照記錄不同昆蟲的訪花行為，并捕捉傳粉昆蟲制作標(biāo)本。

在2018年7月13日，隨機(jī)選取30個(gè)次日開放且蕾長(zhǎng)基本一致的花蕾，套袋，待開花后除袋，當(dāng)花被傳粉昆蟲第1次訪問后，立即將柱頭置于體積分?jǐn)?shù)50%FAA溶液中固定，使用Eclipse E200光學(xué)顯微鏡統(tǒng)計(jì)柱頭上的花粉數(shù)量(即柱頭花粉落置數(shù))，每種傳粉昆蟲重復(fù)統(tǒng)計(jì)30次。

1.3 數(shù)據(jù)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用One-way ANOVA法對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，并對(duì)花蜜含糖量與地表溫度和地表空氣相對(duì)濕度的關(guān)系進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 射干的花部特征及開花進(jìn)程

觀察結(jié)果顯示：射干具頂生復(fù)蝎尾狀聚傘形花序，花莖呈叉狀分枝，頂端聚生數(shù)朵花，并沿花序自上而下開放。射干的花被片呈橙至橙紅色，散生紅褐色斑點(diǎn)；花被管呈圓柱形且極短；花被片6枚，分為2輪，交互排列。花冠呈輻射對(duì)稱狀，直徑54.80±4.46 mm；外輪花被片3枚，呈長(zhǎng)橢圓形，長(zhǎng)31.22±3.16 mm，寬11.60±1.31 mm，花被片距基部約1/3區(qū)域?yàn)槊鄣溃始t褐色；內(nèi)輪花被片3枚，較外輪花被片略短狹，長(zhǎng)28.00±2.56 mm，寬10.46±0.97 mm；雌蕊長(zhǎng)22.22±1.60 mm，位于3枚雄蕊的中央位置，花柱分枝稍扁，呈橙色，柱頭頂端三裂，裂片邊緣略向外反卷，密生短腺毛；雄蕊長(zhǎng)20.32±1.68 mm，著生于外輪花被片基部，花藥為基生藥，位于柱頭下方，呈黃色，向外縱裂；子房長(zhǎng)9.00±1.16 mm，呈倒卵形，中軸胎座，具3室。

觀察和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：射干的花期為6月至8月，單株花期為10～30 d，單花花期為12 h，始花期為6月12日至6月21日，盛花期為6月22日至7月15日，末花期為7月16日至8月3日?；ü谠?：00左右初開(圖1-1)，此時(shí)花藥尚未開裂，柱頭已分化出密集的短腺毛；花冠在8：00左右盛開(圖1-2)，此時(shí)花藥開裂并開始散粉，雌蕊偏向一側(cè)，距雄蕊約1.5 cm；花冠在16：30至17：00初閉合(圖1-3)，內(nèi)輪花被片較外輪花被片先合攏；花冠在18：30至19：00完全閉合(圖1-4)，柱頭萎蔫變軟；花冠在次日呈螺旋狀卷曲(圖1-5)。

1. 初開 Initial opening； 2. 盛開 Blossoming； 3. 初閉合 Initial closing； 4. 完全閉合 Complete closing； 5. 螺旋狀卷曲Spiraling.圖1 射干的開花進(jìn)程Fig. 1 Flowering process of Belamcanda chinensis (Linn.) Redouté

觀察發(fā)現(xiàn)，射干的花具3枚蜜腺，分別位于3枚外輪花被片蜜道的基部，且在蜜道表面可見蜜汁。蜜腺的解剖結(jié)構(gòu)和表面微形態(tài)特征觀察結(jié)果(圖2)顯示：成熟的蜜腺由分泌表皮、泌蜜組織和維管束組成，其中，泌蜜組織由5～7層薄壁細(xì)胞組成，內(nèi)側(cè)與外輪花被片中的維管束相鄰，并且，可見維管束中的篩管分子和導(dǎo)管分子伸入泌蜜組織，說明射干花的蜜腺屬于結(jié)構(gòu)型蜜腺；蜜腺的表皮細(xì)胞呈柱狀，排列緊密，表皮均勻覆蓋著1層角質(zhì)層，經(jīng)PAS法染色后呈紅色，并且，分泌表皮上未見氣孔分布；泌蜜組織細(xì)胞呈多角狀，大小不一，排列較緊密，細(xì)胞核明顯，原生質(zhì)濃厚，細(xì)胞壁較薄，表面有角質(zhì)層包被，但在盛花期部分角質(zhì)層有破損。觀察還發(fā)現(xiàn)，蜜腺的表皮細(xì)胞呈長(zhǎng)條狀，表面無(wú)特殊紋飾。

OP： 外輪花被片 Outer perianth； Ne： 蜜腺 Nectary； An： 花藥 Anther； St： 柱頭 Stigma； IP： 內(nèi)輪花被片 Inner perianth； VB： 維管束 Vascular bundle； Cu： 角質(zhì)層 Cuticula； SG： 淀粉粒 Strach grain； SE： 分泌表皮 Secretory epidermis； NT： 泌蜜組織 Nectariferous tissue； VM： 導(dǎo)管分子 Vessel member； STM： 篩管分子Sieve tube member； NP： 蜜道 Nectar passage； Ho： 蜜汁 Honeydew.1-4. 蜜腺的解剖結(jié)構(gòu)Anatomical structure of nectary： 1. 花蕾橫切面 Transverse section of flower bud； 2. 花蕾基部縱切面 Longitudinal section of the bottom of flower bud； 3. 蜜腺橫切面 Transverse section of nectary； 4. 蜜腺內(nèi)維管組織 Vascular tissue in nectary. 5-6. 蜜腺表面微形態(tài)特征Surface micro-morphological characteristics of netary： 5. 蜜道 Nectar passage； 6. 蜜腺表面 Nectary surface.圖2 射干花蜜腺的解剖結(jié)構(gòu)及表面微形態(tài)特征Fig. 2 Anatomical structure and surface micro-morphological characteristics of flower nectary of Belamcanda chinensis (Linn.) Redouté

2.2 射干的花粉活力及柱頭可授性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1、圖3和圖4)表明：射干的花粉在花藥尚未散粉時(shí)就具有一定的活力，在初開2 h左右(9：00)活力最強(qiáng)，此后活力逐漸下降。射干柱頭在花藥開裂前(7：00)就具有一定的可授性；在開花后2～4 h(9：00至11：00)，柱頭的可授性較強(qiáng)，此時(shí)，柱頭腺毛由疏變密，分泌的粘液也逐漸增多；在開花后6～8 h(13：00至15：00)，柱頭的可授性最強(qiáng)，此時(shí)，柱頭腺毛密集，布滿粘液；此后柱頭可授性隨時(shí)間推移逐漸下降。比較發(fā)現(xiàn)，射干的花粉活力與柱頭可授性的變化趨勢(shì)相似，均隨著開花進(jìn)程先升高后降低，但變化不完全同步，柱頭可授性變化滯后于花粉活力變化。

2.3 射干繁育系統(tǒng)類型分析

實(shí)驗(yàn)測(cè)得射干花冠的平均直徑為54.80 mm，遠(yuǎn)大于6 mm，此項(xiàng)值為3；開花時(shí)，柱頭與花藥空間位置分離，柱頭偏向一側(cè)，此項(xiàng)值為1；雄蕊先于雌蕊成熟，此項(xiàng)值為1。根據(jù)上述3項(xiàng)值計(jì)算得到射干的雜交指數(shù)(OCI)為5，根據(jù)Dafni[18]的標(biāo)準(zhǔn)，確定射干的繁育系統(tǒng)以異交為主，需要傳粉者，并存在部分自交親和。

時(shí)間Time花粉活力/%Pollen viability柱頭可授性Stigma receptivity7:0063.5±1.9具一定可授性 A certain receptivity9:0094.9±8.6可授性較強(qiáng) Stronger receptivity11:0091.3±4.4可授性較強(qiáng) Stronger receptivity13:0081.7±2.7可授性最強(qiáng) The strongest receptivity15:0065.3±4.3可授性最強(qiáng) The strongest receptivity17:0035.8±1.5可授性較強(qiáng) Stronger receptivity19:0026.6±2.1部分具可授性 Some with receptivity

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：射干的平均花粉粒數(shù)為47 530.0，平均胚珠數(shù)為29.8，花粉/胚珠比(P/O)為1 595.0，根據(jù)Cruden[19]的標(biāo)準(zhǔn)，確定射干的繁育系統(tǒng)為兼性異交。

1-3. 解剖觀察 Anatomical observation： 1. 尚未成熟的柱頭 Immature stigma； 2. 成熟的柱頭 Mature stigma； 3. 萎蔫的柱頭 Wilting stigma. 4-6. 肉眼觀察 Visual inspection： 4. 尚未成熟的柱頭 Immature stigma； 5. 成熟的柱頭 Mature stigma； 6. 萎蔫的柱頭 Wilting stigma.圖3 射干開花過程中柱頭的形態(tài)變化Fig. 3 Morphological changes of stigma of Belamcanda chinensis (Linn.) Redouté during flowering process

1. 具一定可授性的柱頭 Stigma with a certain receptivity； 2. 可授性較強(qiáng)的柱頭 Stigma with stronger receptivity； 3. 可授性最強(qiáng)的柱頭 Stigma with the strongest receptivity； 4. 無(wú)可授性的柱頭 Stigma without receptivity.圖4 射干不同可授性柱頭的形態(tài)特征Fig. 4 Morphological characteristics of stigma of Belamcanda chinensis (Linn.) Redouté with different receptivities

授粉試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明：T1組(花蕾直接套袋)和T2組(花蕾去雄蕊后套袋)的坐果率和結(jié)籽率均為0.0%，種子數(shù)也為0.0，說明若沒有傳粉昆蟲射干無(wú)法完成授粉過程，并且實(shí)驗(yàn)過程中未發(fā)現(xiàn)無(wú)融合生殖現(xiàn)象。T3組(花蕾剝?nèi)ネ暾廨喕ū黄筇状?，次日自然授?、T4組(花蕾剝?nèi)ネ廨喕ū黄Ａ裘鄣篮筇状稳兆匀皇诜?和T5組(花蕾剝?nèi)ト炕ū黄筇状?，次日自然授?的坐果率、種子數(shù)和結(jié)籽率均無(wú)顯著差異，但與T9組(花蕾直接套袋，次日自然授粉)相比，坐果率變化不顯著，種子數(shù)和結(jié)籽率則顯著下降，說明花被片和蜜道是射干吸引傳粉昆蟲的重要花部特征。T6組(花蕾剝?nèi)バ廴锖筇状?，次日自花授?、T7組(花蕾剝?nèi)バ廴锖筇状?，次日同株異花授?和T8組(花蕾剝?nèi)バ廴锖筇状?，次日異株授?間的種子數(shù)存在顯著差異，坐果率分別為36.7%、56.7%和73.3%，種子數(shù)分別為15.4、21.8和26.8，結(jié)籽率分別為51.7%、73.2%和89.9%；其中，T7組和T8組與T9組的種子數(shù)存在顯著差異，而T6組與T9組的種子數(shù)無(wú)顯著差異，說明射干的繁育系統(tǒng)以異交為主，并具有一定的自交親和性。

2.4 射干的泌蜜節(jié)律及其訪花昆蟲的傳粉行為分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表3)顯示：射干的單花日泌蜜總量為19.2～31.6 μL。射干花的泌蜜量隨時(shí)間推移呈先升高后降低的日變化趨勢(shì)，花蜜含糖量在7：00至13：00隨時(shí)間推移逐漸升高。射干花在7：00已分泌出少量花蜜，但花蜜含糖量較低(18%)；在9：00泌蜜量最大(10.3 μL)，為泌蜜高峰期；在13：00花蜜含糖量最高(56%)；在15：00蜜腺陸續(xù)停止泌蜜，花被片上可見蜜痕但無(wú)法采集到花蜜；17：00以后徹底停止泌蜜。相關(guān)性分析結(jié)果顯示：射干花蜜含糖量與地表溫度呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，與地表空氣相對(duì)濕度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.993和-0.995。

授粉試驗(yàn)2)Pollination test2)坐果率/%Fruit setting rate種子數(shù)Seed number結(jié)籽率/%Seed setting rateT10.00.0±0.0e0.0±0.0eT20.00.0±0.0e0.0±0.0eT333.33.0±0.9d10.1±3.0dT426.73.8±0.9d12.8±3.0dT520.02.8±0.5d9.4±1.7dT636.715.4±2.2c51.7±7.4cT756.721.8±2.4b73.2±8.1bT873.326.8±2.8a89.9±9.4aT9 (CK)26.715.5±3.2c52.0±10.7c

1)同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference.

2)T1： 花蕾直接套袋 Bagging flower buds directly； T2： 花蕾去雄蕊后套袋 Bagging flower buds after emasculation； T3： 花蕾剝?nèi)ネ暾廨喕ū黄筇状?，次日自然授?Bagging flower buds after stripping complete outer perianths, and natural pollination on the next day； T4： 花蕾剝?nèi)ネ廨喕ū黄Ａ裘鄣篮筇状?，次日自然授?Bagging flower buds after stripping outer perianths but keeping nectar passage, and natural pollination on the next day； T5： 花蕾剝?nèi)ト炕ū黄筇状稳兆匀皇诜?Bagging flower buds after stripping all perianths, and natural pollination on the next day； T6： 花蕾剝?nèi)バ廴锖筇状稳兆曰ㄊ诜?Bagging flower buds after emasculation, and self-pollination on the next day； T7： 花蕾剝?nèi)バ廴锖筇状?，次日同株異花授?Bagging flower buds after emasculation, and geitonogamy on the next day； T8： 花蕾剝?nèi)バ廴锖筇状?，次日異株授?Bagging flower buds after emasculation, and xenogamy on the next day； T9： 花蕾直接套袋，次日自然授粉 Bagging flower buds directly, and natural pollination on the next day.

觀察和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：射干的訪花昆蟲有17種，其中傳粉昆蟲有5種，隸屬于膜翅目(Hymenoptera)和鱗翅目(Lepidoptera)。由表3可見：蜂類的訪花次數(shù)總體上明顯高于蝶類，昆蟲日訪花總次數(shù)呈“雙峰型”變化，2個(gè)峰值分別出現(xiàn)在9：00和15：00。觀察發(fā)現(xiàn)，射干花開放后不久(7：00)墨胸胡蜂(VespavelutinanigrithoraxBuysson)和黑帶食蚜蠅(EpisyrphusbalteatusDe Geer)首先訪花，此時(shí)花藥尚未開裂，二者的訪花報(bào)酬僅為含糖量較低的花蜜；9：00，蜂類的訪花次數(shù)最多，蝶類尚未開始訪花；11：00至13：00，由于氣溫較高(達(dá)40 ℃以上)，大部分昆蟲的活動(dòng)減少，但開始出現(xiàn)盜蜜類昆蟲(如薊馬和螞蟻等)；15：00，傳粉昆蟲以蝶類為主；17：00以后，隨著地表溫度的下降，昆蟲開始回巢，訪花行為逐漸停止。

時(shí)間Time泌蜜量/μLNectar volume花蜜含糖量/%2)Sugar content of honey2)訪花次數(shù) Flower-visiting times蝶類Butterflies蜂類Bees總計(jì)Total7:005.7±1.9b180.0±0.0d11.3±0.5c26.0±2.9c9:0010.3±2.4a310.0±0.0d26.0±2.1a57.0±3.6a11:006.3±1.9b480.0±0.0d14.7±2.0b26.7±4.5c13:002.9±0.6c568.3±0.5b4.0±1.6d23.7±3.7c15:000.2±0.0c—12.3±1.9a0.0±0.0e37.3±9.0b17:000.0±0.0d—1.7±0.5c0.0±0.0e12.6±2.0d19:000.0±0.0d—0.0±0.0d0.0±0.0e0.0±0.0e

1)同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference.

2)—： 花蜜太少，無(wú)法測(cè)定含糖量 Nectar is not enough for determination of sugar content.

觀察和統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表4)表明：中華蜜蜂(ApisceranaceranaFabricius)和意大利蜜蜂(ApismelliferaligusticaSpinola)的單花訪問頻率和被訪花柱頭的花粉落置數(shù)顯著高于其他昆蟲，說明二者為射干的高效傳粉昆蟲，其中，中華蜜蜂和意大利蜜蜂的單次訪花時(shí)間分別為11.6和10.1 s，單花訪問頻率分別為2.5和3.8 min-1。東方菜粉蝶(PieriscanidiaSparrman)、絲帶鳳蝶(SericinusmontelusGrey)和金鳳蝶(PapiliomachaonLinn.)的單次訪花時(shí)間分別為3.5、26.8和24.8 s，單花訪問頻率分別為0.6、0.2和0.3 min-1，說明這3種昆蟲為間斷式訪花，傳粉效率較低。此外，雖然墨胸胡蜂的訪花時(shí)間較長(zhǎng)(7：00至15：00)，且單次訪花時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30.3 s，但蟲體不攜帶射干花粉，因此，墨胸胡蜂是射干的盜蜜者。

傳粉昆蟲Pollination insect單次訪花時(shí)間/sSingle flower-visiting time單花訪問頻率/min-1Visiting frequency of single flower柱頭花粉落置數(shù)Pollen setting number on stigma中華蜜蜂 Apis cerana cerana11.6±3.7b2.5±0.7b44.2±6.8b意大利蜜蜂 Apis mellifera ligus-tica10.1±2.3b3.8±0.8a62.5±15.3a東方菜粉蝶 Pieris canidia3.5±0.9c0.6±0.1c6.9±1.1d絲帶鳳蝶 Sericinus montelus26.8±7.0a0.2±0.0d12.1±3.2c金鳳蝶 Papilio machaon24.8±3.9a0.3±0.0d15.8±4.8c

1)同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference.

3 討論和結(jié)論

植物的花部特征受傳粉者、植食性動(dòng)物及環(huán)境因子等多種因子的影響[21]，其中傳粉者的影響最重要。按照“最有效傳粉者原則”[22]，植物的花部結(jié)構(gòu)常與其最頻繁訪問者且最有效傳粉者相適應(yīng)，例如，鳶尾(IristectorumMaxim.)的花藥隱藏于花柱之下，并具有垂瓣等花部結(jié)構(gòu)特征，適應(yīng)于黃胸木蜂(XylocopaappendiculataSmith)等大型昆蟲傳粉[23]。射干花在早晨開放，顏色艷麗，具有較大的花冠和極短的花被管，花器官結(jié)構(gòu)特化程度較低，花粉量較大，具蜜腺且花被片上具有明顯的指向蜜腺的斑點(diǎn)，這些花部特征說明射干為典型的蟲媒花。

實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，射干花具3枚蜜腺，分別位于射干外輪花被片蜜道的基部，與Rudall等[24]的研究結(jié)論(射干花的蜜腺位于花被管基部，極有可能位于雄蕊間)不完全一致。但射干的子房心皮完全愈合，說明其蜜腺不屬于隔膜蜜腺。Fahn[25]提出蜜腺位置演化的“向心向頂”原則，鄧彥斌等[26]提出蜜腺演化方向?yàn)榫S管束從無(wú)到有，根據(jù)上述觀點(diǎn)，認(rèn)為射干花的蜜腺是一個(gè)較為進(jìn)化的特征。本研究發(fā)現(xiàn)，射干花的蜜腺表皮無(wú)蜜腺毛等紋飾，結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，與鳶尾屬其他植物的蜜腺[24]相比，射干花的蜜腺屬于較原始的類型。另外，根據(jù)射干花的蜜腺結(jié)構(gòu)，推測(cè)在其泌蜜期間，蜜汁由維管束送至泌蜜組織中，并且，泌蜜組織細(xì)胞的角質(zhì)層突起形成角質(zhì)層下腔，當(dāng)壓力達(dá)到一定程度時(shí)，蜜汁經(jīng)泌蜜組織細(xì)胞角質(zhì)層上的小孔泌出體外。

植物的繁育系統(tǒng)有自交、異交和混交等多種類型，但是大自然中絕對(duì)的自交或異交植物很少，多數(shù)植物的繁育系統(tǒng)為混交(同時(shí)具備自交和異交)[27]。綜合P/O值、OCI值及授粉試驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為射干的繁育系統(tǒng)以異交為主，需要傳粉者，并存在部分自交親和；射干可通過雄蕊先熟和柱頭探出式雌雄異位等機(jī)制，避免自花授粉和性別干擾，增強(qiáng)花粉傳遞的精確性，從而提高異交的概率。

黃雙全等[28]認(rèn)為，自然界中兩性花植物結(jié)實(shí)率低通常是因?yàn)榛ǚ巯拗啤①Y源限制、傳粉昆蟲限制等原因。本研究中，T9組(花蕾套袋，次日自然授粉)的結(jié)籽率(52.0%)遠(yuǎn)低于T7組(花蕾去雄蕊后套袋，次日同株異花授粉)和T8組(花蕾去雄蕊后套袋，次日異株授粉)的結(jié)籽率(分別為73.2%和89.9%)，與T6組(花蕾去雄蕊后套袋，次日自花授粉)的結(jié)籽率(51.7%)相近，說明自然狀態(tài)下射干結(jié)籽率與花粉限制及自交不親和障礙無(wú)關(guān)。相關(guān)研究結(jié)果[29-30]表明：鳶尾屬植物花部的垂瓣(即特化的外輪花被片)結(jié)構(gòu)能夠吸引并引導(dǎo)傳粉昆蟲進(jìn)行傳粉活動(dòng)，并保護(hù)花粉和蜜腺免遭盜蜜和盜粉昆蟲的搶食及雨水的沖刷；并且，鳶尾在剝?nèi)ゴ拱旰鬅o(wú)法完成傳粉過程，出現(xiàn)生殖隔離現(xiàn)象。本研究中，T3組(花蕾剝?nèi)ネ暾廨喕ū黄筇状?，次日自然授?的坐果率為33.3%，說明射干外輪花被片的結(jié)構(gòu)和功能尚未完全特化。T5組(花蕾剝?nèi)ト炕ū黄筇状?，次日自然授?的坐果率為20.0%，與T9組坐果率(26.7%)接近，但其結(jié)籽率(9.4%)卻遠(yuǎn)低于T9組；而T4組(花蕾剝?nèi)ネ廨喕ū黄Ａ裘鄣篮筇状稳兆匀皇诜?的結(jié)籽率(12.8%)與T3組(10.1%)無(wú)顯著差異，但顯著低于T9組，說明射干的花被片和蜜腺能顯著影響傳粉昆蟲的傳粉效率，據(jù)此推測(cè)射干的結(jié)籽率可能受傳粉者限制，例如，傳粉者數(shù)量不足以及泛化傳粉者帶來(lái)的其他植物花粉導(dǎo)致胚珠受精率降低等。

根據(jù)射干的泌蜜日節(jié)律和訪花昆蟲日活動(dòng)節(jié)律，發(fā)現(xiàn)在9：00訪花昆蟲的訪花次數(shù)最多，蜂類昆蟲的訪花次數(shù)達(dá)到日峰值，此時(shí)泌蜜量也最大；而在15：00蜜腺陸續(xù)停止泌蜜，因此，無(wú)法采集到足夠的花蜜用于測(cè)量花蜜含糖量，但花蜜含糖量與地表溫度呈極顯著正相關(guān)，與地表空氣相對(duì)濕度呈極顯著負(fù)相關(guān)；15：00，地表溫度為全天最高(44.9 ℃)，地表空氣相對(duì)濕度為全天最低(31%)，推測(cè)此時(shí)花蜜含糖量最高，蝶類傳粉活動(dòng)頻繁，說明射干花的泌蜜特征是對(duì)不同傳粉昆蟲活動(dòng)節(jié)律的適應(yīng)性結(jié)果。一般情況下，傳粉昆蟲的傳粉效率不僅取決于柱頭花粉落置數(shù)，還取決于訪花頻率等因子，傳粉者訪問的花越多，植物的結(jié)籽率越高。射干的傳粉昆蟲有5種，分別是中華蜜蜂、意大利蜜蜂、東方菜粉蝶、絲帶鳳蝶和金鳳蝶，根據(jù)這些傳粉昆蟲的單花訪問頻率和被訪花柱頭的花粉落置數(shù)，判定中華蜜蜂和意大利蜜蜂為射干的高效傳粉昆蟲。

綜上所述，射干花為典型的蟲媒花，結(jié)籽率受傳粉者限制，其花部特征、泌蜜節(jié)律和繁育系統(tǒng)等均對(duì)傳粉昆蟲有良好適應(yīng)性；其繁育系統(tǒng)以異交為主，需要傳粉者，并存在部分自交親和，但未觀察到無(wú)融合生殖現(xiàn)象。