王瑩 ， 賈連群 ， 宋囡 ， 馬藝鑫 ， 具星 ， 楊關(guān)林

（1.遼寧中醫(yī)藥大學中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點實驗室，遼寧沈陽 110847；2.遼寧省中醫(yī)轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，遼寧沈陽 110847）

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛模型大鼠胃腸組織環(huán)磷酸腺苷——蛋白激酶A（cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A，cAMP-PKA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生變化[1，2]。cAMP-PKA途徑是參與物質(zhì)能量代謝的主要細胞傳導(dǎo)通路[3]，而線粒體是細胞能量生成的主要場所，是機體進行能量代謝的主要部位。中醫(yī)脾為“氣血生化之源”，可見，其“主運化”與線粒體能量代謝功能密切相關(guān)。研究表明，魚藤酮處理可導(dǎo)致細胞線粒體產(chǎn)生氧化功能損傷，能量供給不足[4，5]，是線粒體呼吸鏈上復(fù)合體I的經(jīng)典抑制劑之一。故本研究將繼續(xù)以cAMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為切入點，通過比較脾氣虛證模型與不同劑量魚藤酮線粒體損傷模型大鼠胃腸線粒體cAMP-PKA通路相關(guān)基因及蛋白表達變化之相關(guān)性，來探討脾氣虛模型成模及其相關(guān)線粒體的可能機制，以期為臨床脾氣虛證的治療提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（200±10）g，購于本溪實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（遼）-2010-0001。SD大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級環(huán)境中，飼養(yǎng)條件符合國家二級標準，飼養(yǎng)室內(nèi)的溫度保持在（22±2）℃，相對濕度維持在（55±15）%，噪音＜60 dB，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h，每天經(jīng)紫外燈照30 min殺菌。

1.2藥物、試劑與儀器魚藤酮油溶液（美國Sigma公司，批號：R8875-1G），由高壓滅菌葵花油溶解魚藤酮至2 mg/kg，配制成2.0、1.5、1.0 mL/kg等3個劑量[6]?？功?actin抗體（北京中杉金橋公司）；抗PKA抗體、抗磷酸化酶激酶（PHK）抗體、抗糖原磷酸化酶（Gp）抗體（美國ABcam公司）；實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（日本TaKaRa公司，code：DRR047A，DRR820A）；cAMP酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：ml002907）。實驗所需引物由日本TaKaRa公司設(shè)計合成。低速冷凍離心機（美國Thermo公司）；BioSpec-nano型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；Veriti 96 well Thermal Cycler（美國Applied Biosystems公司）；7500 Real Time PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；多功能酶標儀（德國伯托公司）。

1.3分組與模型復(fù)制將30只大鼠隨機分為正常組，脾氣虛組，魚藤酮高、中、低劑量組，每組6只。脾氣虛證模型的造模方法[7]：采用飲食不節(jié)加力竭游泳法，即先飽食1 d，再禁食2 d，3 d為1個循環(huán)，期間自由飲水，并每日游泳至力竭，水溫35～37℃，連續(xù)15 d。若出現(xiàn)食少、神疲乏力、消瘦、毛色枯槁無光澤、便軟或溏則表明造模成功。線粒體損傷模型的造模方法[6]：分別給予魚藤酮高、中、低劑量組大鼠腹腔注射劑量為2.0、1.5、1.0 mL/kg（體質(zhì)量）的無菌魚藤酮油溶液，每日1次，連續(xù)4周，不限飲食。

1.4指標檢測與方法

1.4.1 取材 造模結(jié)束后處死大鼠，取整個胃竇、5 cm空腸組織放入EP管中，-80℃保存。

1.4.2 采用ELISA法測定胃腸組織cAMP含量 分別稱取大鼠胃竇、空腸組織，勻漿，2 500 r/min離心20 min，取上清。根據(jù)試劑盒說明，繪制標準曲線，計算cAMP含量。

1.4.3 蛋白免疫印跡（Western blot）方法測定胃腸組織PKA、PHK、Gp蛋白表達 分別稱取大鼠胃竇、空腸組織100 mg，仔細剝離附著肌肉、結(jié)締組織等，加入1 mL預(yù)冷裂解液（含1%PMSF）充分勻漿，勻漿液于4℃12 000 r/min離心10 min。BCA法測定上清蛋白含量后，上樣，進行十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）1 h，轉(zhuǎn)膜1 h，封閉1 h，一抗（稀釋1∶1 000）孵育4℃過夜。次日二抗（稀釋1∶2 000）孵育1 h后，于暗室中加入ECL發(fā)光液，后曝光30 min，掃描圖像后進行分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以目的蛋白PKA、PHK、Gp與內(nèi)參β-actin條帶的光密度比值（p）表示。

1.4.4 實時RT-PCR法測定胃腸組織PKA、PHK、Gp mRNA表達 分別稱取大鼠胃竇、空腸組織100 mg，仔細剝離附著肌肉、結(jié)締組織等，Trizol法提取其總RNA，其光密度（D）（260 nm）/D（280 nm）均在1.8～2.2。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總RNA 4 μL， 5×PrimeScript Buffer（for real time）2 μL， PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL， RT Primer Mix 1 μL，RNase Free dH2O 4 μL。反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃5 s。cDNA擴增反應(yīng)體系。RNase Free dH2O 9.5 μL，上、下游引物（序列見表 1）各 0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃30 s，60℃30 s，40個循環(huán)。根據(jù)NTC反應(yīng)有無熒光信號檢出并結(jié)合熔解曲線，確認反應(yīng)體系是否有污染。標準曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）＞0.98，擴增效率（E）應(yīng)在0.8～1.2范圍。采用2-△△Ct法對PKA、PHK、Gp基因表達進行相對定量（p），以β-actin為內(nèi)參。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)類型屬于計量資料，均以均數(shù)±標準差（-x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠胃、腸組織cAMP含量比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，脾氣虛組及魚藤酮高、中、低劑量組大鼠胃、腸組織cAMP含量均明顯降低（P＜0.01）；與脾氣虛組比較，魚藤酮高劑量組腸組織cAMP含量及魚藤酮中劑量組胃、腸組織cAMP含量的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2各組大鼠胃、腸組織PKA、PHK、Gp蛋白表達比較圖1、2，表3、4結(jié)果顯示：與正常組比較，脾氣虛組及魚藤酮高、中、低劑量組大鼠胃、腸組織PKA、PHK蛋白表達水平均降低，除魚藤酮低劑量組PHK蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）外，其他差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Gp蛋白有降低趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與脾氣虛組比較，魚藤酮中、低劑量組胃、腸組織PHK，魚藤酮低劑量組胃組織PKA，魚藤酮中劑量組腸組織PKA及魚藤酮高、中、低劑量組大鼠胃、腸組織Gp蛋白表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠胃、腸組織cAMP含量比較Table 2 Comparison of cAMP content in gastrointestinal tissues of various groups[-x±s，c/（pmol·mL-1）]

圖1 各組大鼠胃組織PKA、PHK、Gp蛋白的Western blot電泳條帶Figure 1 The Western blot strips of PKA，PHK and Gp proteins in gastric tissues of various groups

圖2 各組大鼠腸組織PKA、PHK、Gp蛋白的Western blot電泳條帶Figure 2 The Western blot strips of PKA，PHK and Gp proteins in intestinal tissues of various groups

表3 各組大鼠胃組織PKA、PHK、Gp蛋白的表達比較Table 3 Comparison of the protein expression levels of PKA，PHK and Gp in gastric tissues of various groups （-x±s，p）

表4 各組大鼠腸組織PKA、PHK、Gp蛋白的表達比較Table 4 Comparison of the protein expression levels of PKA，PHK and Gp in intestinal tissues of various groups （-x±s，p）

2.3各組大鼠胃、腸組織PKA、PHK、Gp mRNA表達比較表5、6結(jié)果顯示：與正常組比較，脾氣虛組及魚藤酮高、中、低劑量組大鼠胃、腸組織PKA、PHK、Gp mRNA表達水平均降低，除脾氣虛組腸組織Gp mRNA，魚藤酮低劑量組胃組織PKA mRNA及腸組織PHK、Gp mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）外，其他差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與脾氣虛組比較，魚藤酮高、中劑量組大鼠胃組織及魚藤酮高、中、低劑量組腸組織PKA、PHK、Gp mRNA表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表5 各組大鼠胃組織PKA、PHK、Gp mRNA表達比較Table 5 Comparison of the mRNA expression levels of PKA，PHK and Gp in gastric tissues of various groups （-x±s，p）

表6 各組大鼠腸組織PKA、PHK、Gp mRNA表達比較Table 6 Comparison of the mRNA expression levels of PKA，PHK and Gp in intestinal tissues of various groups （-x±s，p）

3 討論

本研究對造模后脾氣虛模型大鼠進行評估，大鼠出現(xiàn)明顯消瘦、神疲乏力、反應(yīng)遲鈍、行動緩慢、被毛蓬起無光澤、便軟等癥狀，表明其符合脾氣虛動物模型標準。利用線粒體呼吸鏈酶抑制劑——魚藤酮復(fù)制線粒體損傷大鼠模型與脾氣虛模型大鼠相比，也不同程度地出現(xiàn)行動緩慢、消瘦、便軟等脾氣虛癥狀。盡管線粒體損傷大鼠模型與脾氣虛組組間個別也有差異，但與正常組比較，2組指標變化趨勢一致并且差異顯著。

“脾主運化”的內(nèi)涵涵蓋了“運”和“化”兩方面，其功能的完成主要在胃腸部。脾主運側(cè)重脾對水谷精微的消化、吸收和轉(zhuǎn)運；脾主化則是指脾將吸收的水谷精微，化生精、氣、血、津液等營養(yǎng)物質(zhì)，即物質(zhì)間的轉(zhuǎn)化及物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰康倪^程[8]。本課題組前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)脾虛證大鼠胃組織與cAMP/PKA信號通路有關(guān)[1，2]。本研究在本課題組前期研究基礎(chǔ)上側(cè)重通過cAMP/PKA信號通路調(diào)控作用比較線粒體損傷大鼠與脾氣虛證大鼠的胃腸組織中是否存在相關(guān)性。

魚藤酮（rotenone），又稱毒魚藤，是一種沒有顏色和味道的酮類結(jié)晶化合物[9]。魚藤酮具有高度脂溶性，不需要依賴多巴胺轉(zhuǎn)運體就可以直接進入胞質(zhì)內(nèi)，并選擇性地抑制線粒體的呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，使線粒體功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激增強，啟動線粒體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細胞凋亡[10]。本研究應(yīng)用不同劑量魚藤酮干預(yù)，使線粒體能量代謝受礙，復(fù)制線粒體損傷模型。

cAMP是細胞內(nèi)重要的第二信使，發(fā)揮著將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)各種生理活動的媒介作用，它可與cAMP依賴性的PKA的結(jié)合亞基結(jié)合，使其激活。激活后的PKA既可以使細胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)磷酸化而發(fā)揮生物學作用，還可以作用于cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)基因表達。因此，cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細胞內(nèi)機制中占有非常重要的地位[11]。PKA是廣泛存在于動物體內(nèi)的一種蛋白激酶[12]，其調(diào)節(jié)亞基上的2個cAMP結(jié)合位點，PKA與cAMP結(jié)合后，激活催化亞基，使靶蛋白中的絲氨基酸或蘇氨酸磷酸化，從而調(diào)節(jié)細胞功能[13]。PKA是第二信使cAMP依賴的蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)細胞的分化和增殖、離子轉(zhuǎn)運、新陳代謝的調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄等過程[14]。Gp是糖原分解代謝中的關(guān)鍵酶，可以促進糖原分解為葡萄糖為機體提供必需的能量，而Gp的活化需要PHK的激活。PHK是一種多亞基蛋白激酶，它是唯一可以使Gp從非活化型轉(zhuǎn)化成活化型的一種酶，所以它對糖原的分解也發(fā)揮著重要的作用，同時，PHK的活化需要由PKA來完成[15，16]。近年來，國內(nèi)外學者對cAMP與中醫(yī)證型的關(guān)系進行了大量的研究，結(jié)果表明cAMP在虛證、寒證、熱證、血瘀、氣滯等不同中醫(yī)證型中具有不同的變化規(guī)律[17-21]。

本研究主要檢測了cAMP/PKA-PHK-Gp信號傳導(dǎo)通路的各分子表達情況，結(jié)果顯示：與正常組比較，脾氣虛組和不同濃度的魚藤酮組胃、腸cAMP含量，PHK、PKA、Gp蛋白和mRNA表達均有所下降；與脾氣虛組比較，魚藤酮組中胃、腸組織與脾氣虛組胃、腸cAMP含量，PHK、PKA、Gp蛋白和mRNA表達水平均無顯著性差異。提示以cAMP/PKA-PHK-Gp信號傳導(dǎo)通路為切入點，應(yīng)用魚藤酮干預(yù)造成線粒體損傷模型與脾氣虛證模型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變具有一定的相似性，二者進行對比可進一步促進脾虛證候研究，這也為中醫(yī)臟象的生物學機制研究提供了新的方向。下一步我們將繼續(xù)以線粒體為靶點，對脾藏象開展“微觀”與“宏觀”相結(jié)合的研究，為深入挖掘脾藏象的科學內(nèi)涵提供依據(jù)，從而指導(dǎo)臨床診斷和治療。