外源Ca對(duì)旱柳Cd毒害的緩解作用

李崇豪，薛文秀，尚曉碩，鄒金華，蔣志勤

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387； 2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387；3.天津師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，天津300387）

鎘（Cd）是自然界較為常見(jiàn)的重金屬元素，因其毒性大、不能被微生物降解等原因備受關(guān)注.Cd 對(duì)植物有較強(qiáng)的毒害作用：①抑制細(xì)胞有絲分裂，使生物量下降；②影響植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，導(dǎo)致物質(zhì)合成和代謝紊亂；③使植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧，對(duì)內(nèi)膜系統(tǒng)造成嚴(yán)重傷害[1].Ca 是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需元素，參與植物體內(nèi)眾多的生理生化反應(yīng)[2]，對(duì)于植物抵抗逆境脅迫和提高重金屬耐性也具有重要作用[3-4].研究表明，Ca 能有效降低植物的Cd 吸收，這是因?yàn)槎呔哂邢嗨频幕瘜W(xué)性質(zhì)，Ca 是土壤中Cd 吸附位點(diǎn)的主要競(jìng)爭(zhēng)者，從而減少Cd 對(duì)植物的毒害作用[3].Toyota 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)的谷氨酸作為一種脅迫或機(jī)械損傷的信號(hào)物質(zhì)，能夠?qū)⑿盘?hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的增加，從而將信號(hào)傳播到遠(yuǎn)端器官并誘導(dǎo)發(fā)生防御反應(yīng).

旱柳是楊柳科（Salicaceae）中常見(jiàn)的樹(shù)種，因其具有根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)快、易繁殖等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于園林綠化中[6].研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，柳樹(shù)在吸收、積累以及修復(fù)土壤Cd 污染方面具有較大的潛力.如Greger 等[7]報(bào)道柳樹(shù)是Cd高積累型植物，對(duì)Cd 的富集能力優(yōu)于超積累植物遏藍(lán)菜（Thlaspi arvense L），但柳樹(shù)僅適用于低、中等劑量環(huán)境Cd 污染；賈中民等[8]的研究表明，培養(yǎng)液的Cd 質(zhì)量濃度小于10 mg/L 時(shí)，垂柳和旱柳萌條均具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)適應(yīng)性，旱柳對(duì)Cd 的耐受能力大于垂柳，旱柳地上部分積累的Cd 含量和Cd 向地上部分的轉(zhuǎn)移系數(shù)均大于垂柳.本課題組以旱柳為實(shí)驗(yàn)材料，采用水培法，研究外源Ca 對(duì)于Cd 脅迫下旱柳生理特征的影響，包括光合色素含量、光合日進(jìn)程、保護(hù)酶活性、丙二醛含量等，為環(huán)境重金屬污染的生物修復(fù)提供參考.

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

一年生旱柳（Salix matsudana Koidz）枝條，取自天津師范大學(xué)科技園.

1.1.2 試劑與儀器

氯化鎘（CdCl2·2.5H2O），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；硝酸鈣，北京市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司.

紫外分光光度計(jì)（Lambda 35 UV/Vis Spectrometer），美國(guó)Perkin Elmer 公司； 便攜式光合儀（LI6400XT），美國(guó)LI-COR 公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物材料的培養(yǎng)和處理

把修剪好的旱柳枝條分為4 組，每組28 枝，固定在培養(yǎng)盆上，用蒸餾水進(jìn)行培養(yǎng).待長(zhǎng)出一定的根后，更換為1/2 Hoagland 培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d 后更換為Hoagland全培養(yǎng)液.設(shè)置4 個(gè)處理：對(duì)照組；Ca 處理組，Ca2+濃度為5 mmol/L；Cd 處理組，Cd2+濃度為50 μmol/L；Ca+Cd處理組，Ca2+濃度為5 mmol/L，Cd2+濃度為50 μmol/L.室溫下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)周期為28 d，每7 d 更換一次處理液，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程通氣.

1.2.2 光合色素含量的測(cè)定

嘉琪對(duì)于自己的舞蹈，要求非常嚴(yán)格。每次要出去比賽或是要準(zhǔn)備考試之前，嘉琪都會(huì)主動(dòng)在寫(xiě)完作業(yè)后，對(duì)著母親從廢物回收站買回來(lái)的鏡子跳上1個(gè)小時(shí)，每個(gè)周末，她還會(huì)去廣州跟著老師學(xué)3個(gè)小時(shí)。即便有學(xué)業(yè)的壓力，她也沒(méi)有放棄過(guò)跳舞。

在添加處理液后的7、14、21、28 d，剪取各處理組葉片，沖洗干凈，吸干葉片表面水分.準(zhǔn)確稱取0.2 g 葉片，采用丙酮法進(jìn)行萃取、定容，分別測(cè)定663、646、670 nm下的吸光度，葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量的具體測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[9].

1.2.3 光合日進(jìn)程測(cè)定

在加入處理液后的第14 d，使用便攜式光合儀進(jìn)行光合日進(jìn)程測(cè)定.分別在8 ∶00、10 ∶00、12 ∶00、14 ∶00、16 ∶00 測(cè)定旱柳植株的各項(xiàng)光合數(shù)據(jù).測(cè)定內(nèi)容為：凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）.

1.2.4 保護(hù)酶活性的測(cè)定

以0.05 mol/L 的磷酸緩沖液為提取液，提取SOD、POD、CAT 3 種保護(hù)酶的粗酶液.具體的提取液制備和酶活性測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[9-10].

1.2.5 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定

用體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液提取旱柳葉片和根中的丙二醛，采用TBA 比色法[9]測(cè)定葉片和根中MDA 的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用SigmaPlot10.0 軟件和WPS 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)旱柳葉片光合色素含量的影響

不同處理組中，旱柳葉片的3 種光合色素含量如圖1 所示.由圖1 可以看出，4 個(gè)處理組中，葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量均是對(duì)照組最高，其次是添加外源Ca 的處理組，二者的光合色素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其余2 組（P ＜0.05）；再次是Ca+Cd 組，光合色素含量明顯高于Cd 脅迫處理組；Cd 脅迫處理組中的光合色素含量始終最低.由此可見(jiàn)，外源Ca 的添加能夠緩解Cd 脅迫造成的旱柳光合色素含量的下降.

比較4 個(gè)處理組中3 種光合色素含量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，總的來(lái)看，對(duì)照組和Ca 處理組的趨勢(shì)相近，Ca+Cd 處理組和Cd 處理組的趨勢(shì)相近.

2.2 不同處理對(duì)旱柳葉片光合日進(jìn)程的影響

不同處理組中，旱柳的光合日進(jìn)程如圖2 所示.由圖2 可以看出，4 個(gè)處理組中，對(duì)照組的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳濃度始終最大，尤其是蒸騰速率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他3 組的數(shù)值；其次是Ca 處理組，4 項(xiàng)光合作用指標(biāo)的數(shù)值低于對(duì)照組，均高于Ca+Cd 處理組和Cd 處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；再次是Ca+Cd 處理組，凈光合速率等顯著高于Cd 處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）.這說(shuō)明外源Ca 的添加確實(shí)緩解了Cd 脅迫造成的旱柳光合作用的下降.4 個(gè)處理組中旱柳的凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度日進(jìn)程均為典型的雙峰曲線，Cd 脅迫下，旱柳的光合日進(jìn)程雖呈雙峰曲線，但變化較為平緩，添加了外源Ca 后，凈光合速率等顯著增加，變化幅度增大.

圖1 不同處理組中旱柳葉片3 種光合色素的含量Fig.1 Contents of three kinds of photosynthetic pigments in leaves of S.matsudana in different groups

圖2 不同處理組中旱柳的光合日進(jìn)程Fig.2 Photosynthetic daily process of S.matsudana in different groups

2.3 不同處理對(duì)旱柳保護(hù)酶活性和MDA 的影響

4 個(gè)處理組中，旱柳葉片和根中的SOD 酶活性如圖3 所示.由圖3（a）可以看出，Cd 處理組中旱柳葉片的SOD 酶活性最大，其次是Ca+Cd 組，對(duì)照組的數(shù)值最低.由圖3（b）可以看出，對(duì)照組根中的SOD 酶活性最大，其次是Ca 處理組，Cd 處理組中的數(shù)值最低.旱柳葉片和根中的POD 活性如圖4 所示.由圖4 可以看出，旱柳葉片和根中均是Cd 處理組的POD 活性最大，其次是Ca+Cd 組，對(duì)照組的數(shù)值最低.旱柳葉片和根中的CAT 活性如圖5 所示.

圖3 不同處理組中旱柳的SOD 活性Fig.3 SOD activity of S.matsudana in different groups

圖4 不同處理組中旱柳的POD 活性Fig.4 POD activity of S.matsudana in different groups

圖5 不同處理組中旱柳的CAT 活性Fig.5 CAT activity of S.matsudana in different groups

由圖5 可以看出，旱柳葉片和根中的CAT 活性均是在對(duì)照組中的數(shù)值最大，其次是Ca 處理組，Cd 處理組中的活性最低.

旱柳葉片和根中的MDA 含量如圖6 所示.由圖6可以看出，葉片和根中均是Cd 處理組的MDA 含量最大，其次是Ca+Cd 處理組，對(duì)照組的MDA 含量最低.由此可見(jiàn)，Cd 脅迫確實(shí)能夠?qū)盗斐蛇^(guò)氧化損傷，外源Ca 則能夠緩解這種損傷.

圖6 不同處理組中旱柳的MDA 含量Fig.6 MDA contents of S.matsudana in different groups

3 討論與結(jié)論

Cd 是植物生長(zhǎng)發(fā)育中的非必需微量元素，它對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有顯著抑制作用[11].本研究用50 μmol/L的CdCl2處理旱柳枝條，發(fā)現(xiàn)Cd 處理顯著降低了旱柳葉片的葉綠素含量和光合作用效率，對(duì)葉片和根的保護(hù)酶系統(tǒng)以及MDA 含量都有不同程度的影響，而外源Ca 的添加則會(huì)緩解旱柳因Cd 脅迫而遭受的損傷.

光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)生命活動(dòng)，葉綠素含量是決定光合作用的基礎(chǔ)，同時(shí)也是可以代表光合作用強(qiáng)度的指標(biāo)[12].Cd 脅迫下旱柳葉片葉綠素含量減少的原因可能是：①Cd 進(jìn)入植物體內(nèi)占據(jù)了葉綠素合成酶相應(yīng)的離子結(jié)合位點(diǎn)，造成酶的失活[13]；②Cd脅迫下，植物產(chǎn)生過(guò)量的過(guò)氧化物和超氧化物加速了葉綠素的分解，從而導(dǎo)致葉綠素含量的降低； ③Cd脅迫影響植物細(xì)胞正常的分裂分化，內(nèi)膜系統(tǒng)遭到破壞，從而降低了葉綠素含量[14].添加外源Ca 后，旱柳葉綠素含量有顯著提高，即外源Ca 可以在一定程度上緩解Cd 對(duì)旱柳葉綠素的損傷[15].但過(guò)多的Ca進(jìn)入植物細(xì)胞則會(huì)造成光合色素含量的降低[16]，本研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加Ca 時(shí)旱柳的葉綠素含量也會(huì)減少.

Cd 脅迫降低了旱柳的凈光合速率、胞間二氧化碳濃度、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率.一方面，可能是因?yàn)镃d影響了光合作用中PSⅡ催化中心的金屬結(jié)合位點(diǎn)[17]；另一方面，Cd 進(jìn)入植物細(xì)胞后會(huì)抑制植物對(duì)Mg2+的吸收，而后者是構(gòu)成葉綠素的必需元素且在光合作用中有著重要的催化作用[18].相關(guān)研究表明，外源Ca 的添加能夠促進(jìn)Mg2+在光合作用中的電子傳遞，從而提高植物的光合作用[19].本研究也證實(shí)了外源Ca 的添加能夠顯著緩解Cd 脅迫對(duì)旱柳光合作用的負(fù)面影響.

當(dāng)植物受到Cd 脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的過(guò)氧化物[19]，引起細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的損傷，從而抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育.植物體內(nèi)的SOD、POD、CAT 酶是保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化物傷害的保護(hù)酶，在植物受到過(guò)氧化物傷害時(shí)大量合成[20].SOD 酶可以將超氧陰離子自由基歧化成H2O2和O2；POD 酶可以通過(guò)愈創(chuàng)木酚作為電子供體在底物氧化過(guò)程中清除H2O2；CAT 酶可以將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2.添加外源Ca 后，葉片和根中的保護(hù)酶活性均發(fā)生了顯著變化，證明Ca 作為第二信使可以通過(guò)鈣調(diào)蛋白影響蛋白激酶的活性，在一定程度上緩解了Cd 對(duì)旱柳的傷害作用[21].

MDA 是植物體受到外界脅迫時(shí)膜質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量可以反映植物受到傷害的程度[22].本研究中Cd 處理組葉片和根的MDA 含量均顯著高于其他處理組，證明Cd 脅迫導(dǎo)致旱柳體內(nèi)發(fā)生了大量的膜質(zhì)過(guò)氧化作用.在添加Ca 后，旱柳根和葉片中的MDA含量均明顯降低，證明Ca 對(duì)Cd 脅迫造成的旱柳膜質(zhì)過(guò)氧化具有緩解作用[23].

綜上所述，外源Ca 能夠通過(guò)提高植物的葉綠素含量和光合作用效率、影響保護(hù)酶系統(tǒng)、降低MDA 含量等，緩解Cd 污染環(huán)境中旱柳遭受的毒害.因此，在利用旱柳修復(fù)環(huán)境重金屬污染中，可以適度添加Ca，以此緩解Cd 對(duì)旱柳生長(zhǎng)的破壞作用，提高旱柳的成活率.