基于棉花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

劉冬梅 婁喜艷 吳狄

摘要：通過(guò)對(duì)棉花轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序獲得的57 695條Unigenes，利用MISA軟件進(jìn)行搜索，得出簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR）的分布情況，共挖掘檢索得到1 886個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR的出現(xiàn)頻率為3.27%。所有SSR位點(diǎn)分布于1 759條Unigenes上，發(fā)生頻率為3.05%，平均每20.8 kb會(huì)出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)。有117條Unigenes含有1個(gè)以上SSR位點(diǎn)，含有復(fù)合型SSR的Unigenes數(shù)目為56條，其中三核苷酸基元類型分布最多，SSR數(shù)量為 1 582個(gè)，占挖掘出總SSR數(shù)量的83.88%，而單、二、四、五、六核苷酸重復(fù)類型所占的比例較小。最后通過(guò)Primer 3程序進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)，得到部分引物序列，可用于棉花遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種以及種質(zhì)資源的保存等。

關(guān)鍵詞：棉花;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;SSR;分子標(biāo)記;引物設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)： S562.024 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）07-0032-03

微衛(wèi)星DNA，即簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR），通常構(gòu)成其重復(fù)基元的核苷酸個(gè)數(shù)為1～6個(gè)，特點(diǎn)是長(zhǎng)度長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸，為串聯(lián)重復(fù)序列。單一序列的保守性較強(qiáng)，在基因組中，微衛(wèi)星側(cè)翼序列就有此特性。因此首先通過(guò)克隆相應(yīng)的微衛(wèi)星側(cè)翼DNA片段，對(duì)其數(shù)目進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增DNA進(jìn)行全部測(cè)序，再對(duì)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列引物進(jìn)行人工合成，最終實(shí)現(xiàn)通過(guò)PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星的目的。自分子領(lǐng)域發(fā)展以來(lái)，人們最常用的分子標(biāo)記技術(shù)主要有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、SSR等[1-6]。與其他分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，（1）SSR標(biāo)記的操作非常簡(jiǎn)便，無(wú)需消耗大量試驗(yàn)器材即可進(jìn)行，整個(gè)過(guò)程消耗的時(shí)間較其他幾種分子標(biāo)記短，且對(duì)于多態(tài)性而言，SSR標(biāo)記所發(fā)掘出的多態(tài)性較高;（2）SSR標(biāo)記所開(kāi)發(fā)的位點(diǎn)具有多等位基因的特性，且在分子水平上，其提供的信息量較高;（3）SSR標(biāo)記識(shí)別出的基因位點(diǎn)呈共顯性，在整個(gè)基因組有著均勻分布，且整個(gè)過(guò)程無(wú)放射、輻射危險(xiǎn)。SSR標(biāo)記適用于DNA指紋圖譜的構(gòu)建[7]、基因定位[8]和遺傳多樣性分析[9]等方面。高度變異是微衛(wèi)星中重復(fù)基元的顯著特性，微衛(wèi)星數(shù)目可呈現(xiàn)出整倍性變異，并且重復(fù)基元序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性。

目前關(guān)于棉花全基因組SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的研究報(bào)道較少，隨著棉花品種數(shù)量的逐漸增多，田間表型農(nóng)藝性狀鑒定方法已難以滿足快速并準(zhǔn)確鑒定品種、質(zhì)量、親緣關(guān)系等的需求。本研究以陸地棉洞A轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果為試驗(yàn)材料，對(duì)全轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)進(jìn)行挖掘，利用生物信息學(xué)技能和MISA軟件，發(fā)掘基于陸地棉洞A基因型的SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，在RNA水平上分析棉花SSR的特點(diǎn)及規(guī)律，以期為在分子水平上研究棉花種質(zhì)資源、鑒定親緣關(guān)系及進(jìn)行分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 棉花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源

2014年8月，以陸地棉洞A不育和可育花藥為材料，委托深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得的全基因序列共包含57 695條Unigenes，以此為材料進(jìn)行SSR位點(diǎn)的挖掘。

1.2 棉花轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)檢索

利用SSR位點(diǎn)挖掘軟件MISA對(duì)陸地棉洞A花藥的 57 695 條Unigenes進(jìn)行SSR位點(diǎn)挖掘，共挖掘出6種不同類別的SSR，分別是單、二、三、四、五、六核苷酸SSR。

1.3 SSR引物挖掘

利用MISA軟件進(jìn)行SSR位點(diǎn)挖掘之前首先將單、二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)次數(shù)的操作參數(shù)分別設(shè)置為 ≥12 bp、≥6 bp、≥5 bp、≥5 bp、≥4 bp、≥4 bp;其次對(duì)長(zhǎng)度條件參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，當(dāng)2個(gè)微衛(wèi)星可以組合為1個(gè)復(fù)合微衛(wèi)星時(shí)，這2個(gè)微衛(wèi)星之間的距離必須小于100 bp。

1.4 引物設(shè)計(jì)

通過(guò)Primer 3程序進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花轉(zhuǎn)錄組序列中SSR位點(diǎn)的數(shù)量

通過(guò)MISA軟件對(duì)棉花轉(zhuǎn)錄組獲得的Unigenes進(jìn)行挖掘，從表1可以看出，共挖掘出1 886個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR出現(xiàn)頻率（搜索出的SSR數(shù)量與搜索序列總數(shù)的比值）為3.27%。所有SSR位點(diǎn)分布于1 759條Unigenes上，發(fā)生頻率（搜索出的含有SSR序列的數(shù)量與搜索序列總數(shù)的比值）為3.05%，平均每20.8 kb會(huì)出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)（搜索出的序列總長(zhǎng)度與SSR總數(shù)量的比值）。其中含有1個(gè)以上SSR位點(diǎn)的Unigenes數(shù)量較少，有117條;含復(fù)合型SSR的序列數(shù)更少，為56條。

2.2 棉花轉(zhuǎn)錄組SSR基元頻率特征及引物設(shè)計(jì)

由表2可知，棉花轉(zhuǎn)錄組的SSR種類較為豐富，本研究共挖掘到86種重復(fù)的SSR類型，且各重復(fù)類型之間的數(shù)量差別較大，分布極其不平衡。棉花轉(zhuǎn)錄組中三核苷酸SSR重復(fù)基元類型的分布最多，SSR重復(fù)基元數(shù)量為1 582個(gè)，占挖掘出總SSR數(shù)量的83.88%;SSR位點(diǎn)數(shù)范圍為1～393個(gè)，最多的為AAG/CTT，其次是ATC/ATG，數(shù)量為 325個(gè)，AGC/CTG的數(shù)量為216個(gè)，ACC/GGT數(shù)量為209個(gè)。單、二、四、五、六核苷酸重復(fù)類型所占的比例較小，SSR重復(fù)基元數(shù)量分別為66、92、15、11、120個(gè)，總比例之和為16.12%。在棉花轉(zhuǎn)錄組Unigenes中，重復(fù)基元類型最多的是六核苷酸，為61種;其次是三核苷酸重復(fù)類型，有10種。從圖1可以看出，在三核苷酸重復(fù)基元類型中，AAG/CTT的SSR位點(diǎn)數(shù)量最多，為393個(gè)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)量的20.84%，發(fā)生頻率為0.68%;其次是ATC/ATG，占總SSR位點(diǎn)數(shù)量的 17.23%;再次是AGC/CTG，占11.45%;ACC/GGT較少，占1108%;其他三核苷酸重復(fù)基元類型占總SSR位點(diǎn)的2328%。單、二、四、五、六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量分別為2、4、3、6種，共占重復(fù)類型總數(shù)的17.44%。通過(guò)對(duì)棉花轉(zhuǎn)錄組57 695條序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，共搜索得到 1 886 個(gè)SSR位點(diǎn)，利用Primer 3引物設(shè)計(jì)程序所得出的部分SSR位點(diǎn)特異引物見(jiàn)表3。

2.3 棉花轉(zhuǎn)錄組序列中SSR基元重復(fù)次數(shù)分布

SSR位點(diǎn)的多態(tài)性是由基元重復(fù)次數(shù)的變化所決定的，通過(guò)棉花SSR位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖2）可以得出，棉花轉(zhuǎn)錄組基元隨著重復(fù)次數(shù)的增加，其數(shù)量和比例逐漸減少。棉花轉(zhuǎn)錄組SSR中基元重復(fù)次數(shù)主要集中在4～7次，占總數(shù)的94.91%，其中重復(fù)8～10次的SSR位點(diǎn)數(shù)量為28個(gè)，占總數(shù)的1.48%;重復(fù)11～14次數(shù)的SSR位點(diǎn)為61個(gè)（3.23%），重復(fù)15～17次的SSR位點(diǎn)有7個(gè)（0.37%），其中重復(fù)16次的SSR位點(diǎn)有0個(gè)。重復(fù)次數(shù)多于20次為較高重復(fù)次數(shù)，棉花轉(zhuǎn)錄組中沒(méi)有重復(fù)次數(shù)高于17次的SSR位點(diǎn)，即無(wú)高重復(fù)次數(shù)的SSR位點(diǎn)，低重復(fù)次數(shù)（重復(fù)1～10次）與一般重復(fù)次數(shù)（重復(fù)11～20次）的SSR位點(diǎn)較多。

3 討論

本研究利用棉花花藥的轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)，從57 695條序列中成功挖掘檢索出1 886個(gè)SSR位點(diǎn)， 棉花轉(zhuǎn)錄組序列中SSR位點(diǎn)的總發(fā)生頻率為3.05%，通過(guò)對(duì)比杜仲（2.90%）[10]、南方紅豆杉（2.07%）[11]可以發(fā)現(xiàn)，棉花轉(zhuǎn)錄組序列中SSR位點(diǎn)的發(fā)生頻率略高，但略低于紅松（4.24%）[12]，且明顯低于櫻桃（15.62%）[13]。棉花轉(zhuǎn)錄組SSR標(biāo)記重復(fù)次數(shù)最多的是三核苷酸重復(fù)基元類型，高級(jí)基元重復(fù)次數(shù)較為微小，且跨度大，可為基元的重復(fù)次數(shù)與SSR標(biāo)記的多態(tài)性呈正相關(guān)提供依據(jù)[14]。三核苷酸中的AAG/CTT基元的豐度最高，這與海甘藍(lán)三核苷酸為豐度最高的基元[15]一致，即棉花轉(zhuǎn)錄組SSR中三核苷酸SSR在理論上具備更高的多態(tài)性，可作為潛在的SSR重復(fù)基序進(jìn)行有關(guān)的引物挖掘及開(kāi)發(fā)。由此推測(cè)，通過(guò)利用棉花轉(zhuǎn)錄組得到的SSR引物，同樣可以用來(lái)進(jìn)行棉花的遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種以及種質(zhì)資源的保存等。

參考文獻(xiàn)：

[1]涂明月，李 杰，何亞麗，等. 利用RAPD標(biāo)記鑒定草地早熟禾種質(zhì)資源的遺傳多樣性[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2017，26（7）：71-81.

[2]石 悅，于肖夏，于 卓，等. 高丹草AFLP分子遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，45（10）：7-14.

[3]曹雯梅，劉述忠，楊青華，等. STS標(biāo)記鑒定河南歷史主推小麥品種春化光周期基因及與品種冬春性的相關(guān)性[J]. 分子植物育種，2016，14（1）：117-124.

[4]王 嬋，趙 泓，張麗英，等. 大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及保持系線粒體基因組RFLP分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，23（7）：888-893.

[5]匡 猛，王延琴，周大云，等. 基于單拷貝SNP標(biāo)記的棉花雜交種純度高通量檢測(cè)技術(shù)[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2016，28（3）：227-233.

[6]Fan C J，Liu Q Y，Zeng B S，et al. Development of simple sequence repeat（SSR）markers and genetic diversity analysis in blackwood（Acacia melanoxylon）clones in China[J]. Silvae Genetica，2016，65（1）：49-54.

[7]宋海斌，崔喜波，馬鴻艷，等. 基于SSR標(biāo)記的甜瓜品種（系）DNA指紋圖譜庫(kù)的構(gòu)建[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（13）：2676-2689.

[8]葉衛(wèi)軍，楊 勇，周 斌，等. 分子標(biāo)記在綠豆遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和基因定位研究中的應(yīng)用[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2017，18（6）：1193-1203.

[9]周麗霞，吳 翼，肖 勇. 基于SSR分子標(biāo)記的油棕遺傳多樣性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，48（2）：216-221.

[10]黃海燕，杜紅巖，烏云塔娜，等. 基于杜仲轉(zhuǎn)錄組序列的SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)[J]. 林業(yè)科學(xué)，2013，49（5）：176-181.

[11]李炎林，楊星星，張家銀，等. 南方紅豆杉轉(zhuǎn)錄組SSR挖掘及分子標(biāo)記的研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2014，41（4）：735-745.

[12]張 振，張含國(guó)，莫 遲，等. 紅松轉(zhuǎn)錄組SSR分析及EST-SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)[J]. 林業(yè)科學(xué)，2015，51（8）：114-120.

[13]宗 宇，王 月，朱友銀，等. 基于中國(guó)櫻桃轉(zhuǎn)錄組的SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與鑒定[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2016，43（8）：1566-1576.

[14]Gao L F，Tang J F，Li H W，et al. Analysis of microsatellites in major crops assessed by computational and experimental approaches[J]. Molecular Breeding，2003，12（3）：245-261.

[15]戚維聰，程計(jì)華，黃邦全，等. 基于海甘藍(lán)RNA-Seq序列開(kāi)發(fā)EST-SSR分子標(biāo)記[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30（5）：997-1002. 司振書，殷國(guó)政，路建彪，等. H9N2亞型AIV雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（7）：35-37.