李玉燕

中圖分類號(hào)：S858.31 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2019）08-0032-03

雞傳染性鼻炎（IC）是由副雞嗜血桿菌（Hpg）引起的一種雞急性上呼吸道傳染病，此病由Beach 首先報(bào)道，De Blieck于1931年初次分離到了該病的病原體，最初命名為雞嗜血紅蛋白鼻炎芽孢桿菌，目前本病在世界許多地方都有發(fā)生和流行[1]。我國(guó)從1980年起就有許多疑似本病的病例出現(xiàn)，首先由馮文達(dá)于1987年在北京分離到細(xì)菌。臨床主要特征是病雞鼻粘膜發(fā)炎，打噴嚏、流鼻涕，且臉部發(fā)生腫脹。雞群在發(fā)病初期具有較低的死亡率，嚴(yán)重影響雞群生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)蛋能力[2] ，而且在發(fā)病后期往往會(huì)由于出現(xiàn)混合感染而導(dǎo)致機(jī)體消瘦，死亡率明顯升高。所以，該病對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害較大，常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。

2019年6月，某父母代場(chǎng)種雞群從28周齡開(kāi)始出現(xiàn)呼吸道癥狀，聽(tīng)雞有啰音，咳嗽、打噴嚏，臨床雞只面部水腫，肉垂出現(xiàn)明顯腫脹，公雞尤為明顯。臨床剖檢死雞發(fā)現(xiàn)鼻腔和眶下竇有粘液性分泌物流出，嚴(yán)重者眶下竇含有大量干酪樣壞死物。臨床種雞群產(chǎn)蛋率下降30%～40%，疑似雞傳染性鼻炎感染。本研究采集臨床發(fā)病雞只的鼻腔拭子和眶下竇拭子，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)發(fā)病原因進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明該父母代種雞群發(fā)病確診為雞傳染性鼻炎感染。

1 ?材料與方法

1.1 ?采集病料 ?送檢疑似雞傳染性鼻炎病死雞，用無(wú)菌棉拭子采集典型發(fā)病雞的眶下竇和鼻腔拭子。

1.2 ?試劑 ?EasyPure Viral DNA/RNA Kit、PCR反應(yīng)試劑盒、瓊脂糖、TAE均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PCR引物由上海英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.3 ?樣品的采集與處理 ?分別采集病雞眶下竇和鼻腔拭子，置于1.5mL離心管中，加入1mL滅菌PBS，放置0.5h后，將棉拭子在管壁上盡量擠干，然后棄至消毒缸內(nèi)。將浸過(guò)棉拭子的離心管充分搖震后，12000r/min離心5min。取上清液用于提取DNA。

1.4 ?樣品的鑒定

1.4.1 ?引物 ?參照宋敏訓(xùn)等[6]發(fā)表的針對(duì)雞傳染性鼻炎aroA基因的序列進(jìn)行PCR鑒別診斷，雞傳染性鼻炎上游引物：5′-TTC CGT TGC CAT TGC ACT C-3′;下游引物：5′-TTA GGC GTG AAG TAT CAG C-3′，擴(kuò)增的目的片段為887bp。

1.4.2 ?DNA的提取 ?參照EasyPure Viral DNA/RNA Kit的說(shuō)明書，對(duì)離心完樣品的上清液提取DNA。

1.4.3 ?目的片段的擴(kuò)增 ?以提取DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。其PCR體系（25μL），見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min;94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸5min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。最后復(fù)延伸10min。

反應(yīng)結(jié)束，取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外光線下觀察并記錄結(jié)果。

2 ?結(jié)果

2.1 ?采集樣品傳染性鼻炎的PCR檢測(cè)結(jié)果 ?10份檢測(cè)樣品中，1、2、3、8號(hào)樣品均有887bp的擴(kuò)增條帶符合預(yù)期大小，4、5號(hào)樣品為可疑感染，見(jiàn)圖1。初步鑒定該雞群存在傳染性鼻炎的感染。

2.2 ?臨床表現(xiàn)與剖檢變化 ?種雞群產(chǎn)蛋率下降30%～40%，發(fā)病嚴(yán)重雞舍周死淘高達(dá)2%。臨床感染雞只精神沉郁，眼瞼部腫脹，剖檢鼻腔和眶下竇有粘液性分泌物流出，嚴(yán)重者眶下竇含有大量干酪樣壞死物。眼結(jié)膜囊內(nèi)有干酪樣物，見(jiàn)圖2～圖5。

3 ?結(jié)論

對(duì)某父母代場(chǎng)種雞群28周齡時(shí)疑似感染雞傳染性鼻炎，采集10份鼻腔拭子和眶下竇拭子樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)發(fā)病原因進(jìn)行鑒定，結(jié)果有6份樣品均獲得預(yù)期大小的目的條帶。結(jié)果表明該父母代雞群發(fā)病確診為雞傳染性鼻炎感染。為今后雞傳染性鼻炎動(dòng)物攻毒保護(hù)試驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了良好的素材。

參考文獻(xiàn)：

[1] ?Y.M.Saif.禽病學(xué)[M].第十二版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2012，930-939.

[2] ?吳清民.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002：287.

[3] ?秦濤.蛋雞副嗜血桿菌病的臨床特點(diǎn)與防治措施[J].現(xiàn)代畜牧科技，2016（10）：92

[4] ?宋勤葉，張冰，周林.混合感染中雞毒支原體和副雞嗜血桿菌的分離鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24（4）：280-282.

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[6] ?宋敏訓(xùn)，陳小玲，牟建青，等.利用aroA基因建立雞傳染性鼻炎PCR診斷方法[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2001，31（10）：7-9.