易金鑫，代應(yīng)貴，孫際佳，張浩然，劉 麗

( 1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學(xué)，特種水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025； 3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，廣東 廣州 510642 )

尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)屬鱸形目、麗鯛科、羅非魚屬，分布于非洲尼羅河流域。尼羅羅非魚自1976年作為優(yōu)良品種被聯(lián)合國糧農(nóng)組織推廣養(yǎng)殖以來，也是我國成功推廣的魚類引進(jìn)養(yǎng)殖品種[1]。早在20世紀(jì)70年代末，珠江流域就開始了尼羅羅非魚的養(yǎng)殖，其中部分尼羅羅非魚個(gè)體自養(yǎng)殖區(qū)逃逸入侵河流并快速繁殖、擴(kuò)散，在該流域建立了野生種群[2]。

外來種入侵是當(dāng)今世界生物學(xué)研究的熱點(diǎn)問題之一[3-4]。外來種入侵到新的環(huán)境，需要克服各種生物及非生物屏障。在入侵過程中，外來種種群的建立、擴(kuò)張要經(jīng)歷自身的演變、適應(yīng)、競爭和暴發(fā)[4]。大多數(shù)外來物種通過不同途徑侵入新區(qū)域時(shí)，初始種群通常是由原產(chǎn)地的少數(shù)個(gè)體繁衍而來，其遺傳多樣性可能比原產(chǎn)地的種群要低得多[4]，但也有少部分種群能克服種群奠基者效應(yīng)，在入侵地建立穩(wěn)定的種群[3]。研究表明，種群豐富的遺傳多樣性是外來種入侵成功的重要保證[5]。

線粒體DNA結(jié)構(gòu)較為簡單，具有分子量小、嚴(yán)格遵循母系遺傳等特點(diǎn)，從而被廣泛用于種群遺傳學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化研究[6]。細(xì)胞色素b(Cytb)基因是mtDNA上唯一的結(jié)構(gòu)和功能被了解得較為清楚的蛋白編碼基因，進(jìn)化速度適中，是研究群體遺傳結(jié)構(gòu)的理想工具，也是魚類種群遺傳多樣性研究常用的標(biāo)記之一[7]。

北盤江為珠江水系西江上游支流。由于受董箐電站大壩的阻隔，目前尼羅羅非魚在北盤江僅擴(kuò)散分布于董箐電站大壩以下北盤江下游河段，并已成為該河段魚類優(yōu)勢(shì)種群[8-9]。迄今為止，尚未見有關(guān)北盤江下游尼羅羅非魚野生群體遺傳多樣性的研究報(bào)道。筆者通過對(duì)北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因序列進(jìn)行全序列測(cè)序，分析其序列變異及遺傳多樣性，闡述北盤江下游尼羅羅非魚群體遺傳多樣性，為評(píng)估該群體對(duì)北盤江下游河段的入侵適應(yīng)能力提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2016年4月于貴州北盤江董箐電站大壩以下下游河段的董箐、白層、樂元、巖架4個(gè)采樣點(diǎn)(圖1)，共采集尼羅羅非魚38尾，體長106～252 mm，體質(zhì)量47.4～576.4 g。每尾魚在背部取其肌肉約為2～3 g，以酒精固定，并于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 北盤江下游尼羅羅非魚樣品采集點(diǎn)

1.2 Cytb基因擴(kuò)增與測(cè)序

使用北京天根生化科技有限公司提供的DNA提取試劑盒提取尼羅羅非魚mtDNA，并用1.00%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量和純度。尼羅羅非魚Cytb基因序列擴(kuò)增以及測(cè)序的引物為：5′CTAATGACTTGAAAAACCACCG 3′，5′TTTGGGAGTTAGGGGTAAGGGT 3′。PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物經(jīng)過1.00%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，選取有良好擴(kuò)增條帶的PCR產(chǎn)物，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行純化及雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

序列輸入BioEdit和Editseq軟件進(jìn)行對(duì)比分析，輔以人工校對(duì)，并從GenBank獲取長度相同的同源序列校對(duì)DNA序列的一致性。運(yùn)用Mega 5分別計(jì)算堿基及氨基酸含量、核苷酸序列差異，采用Dnasp計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)。在GenBank下載莫桑比克羅非魚(O.mossambicus)Cytb基因序列為外群(登錄號(hào)：AY597335.1)，根據(jù)Kimura雙參數(shù)法計(jì)算單倍型遺傳距離，構(gòu)建尼羅羅非魚單倍型鄰接法及最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼羅羅非魚Cytb基因序列變異

通過擴(kuò)增、測(cè)序，并進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，獲得北盤江下游尼羅羅非魚群體長度為1135 bp的Cytb基因序列。

尼羅羅非魚Cytb基因序列中共計(jì)發(fā)現(xiàn)151個(gè)變異位點(diǎn)，每個(gè)變異位點(diǎn)分別含有1～19個(gè)試驗(yàn)魚個(gè)體。這151個(gè)變異位點(diǎn)含116個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)、32個(gè)顛換位點(diǎn)和3個(gè)轉(zhuǎn)換與顛換共存位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)數(shù)明顯多于顛換位點(diǎn)數(shù)(表1)。其中，簡約信息位點(diǎn)為150個(gè)，單一變異位點(diǎn)為1個(gè)。在151個(gè)變異位點(diǎn)中，分布于密碼子第3位點(diǎn)的變異位點(diǎn)為最多、達(dá)134個(gè)，而分布在密碼子第1、2位點(diǎn)的變異位點(diǎn)分別只有16個(gè)、1個(gè)。

表1 北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因及密碼子堿基變異

2.2 尼羅羅非魚Cytb基因編碼氨基酸序列及變異

北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因1135 bp序列共編碼了378個(gè)氨基酸。在這378個(gè)氨基酸組成的多肽序列中，以亮氨酸所占平均比例最高(16.33%)、色氨酸所占平均比例最低(0.41%)。該群體Cytb基因共有133個(gè)同義突變、9個(gè)非同義突變，同義突變顯著多于非同義突變(表2)。在由9個(gè)非同義突變引起的氨基酸變異中，第6位氨基酸變異較多，在單倍型6、12、13由賴氨酸(AAA)變成了谷氨酸(GAA)，在單倍型5、11由賴氨酸(AAA)變成谷氨酰胺(CAA)。第364位氨基酸由異亮氨酸(ATT)變成了纈氨酸(GTT)。第365位氨基酸由亮氨酸(CTC)變成了苯丙氨酸(TTC)。這3個(gè)位點(diǎn)氨基酸變異均由密碼子第1位點(diǎn)堿基突變所致。第360位氨基酸，因密碼子第2位點(diǎn)變異，導(dǎo)致其由苯丙氨酸(TTC)變成了絲氨酸(TCC)。密碼子第3位點(diǎn)突變所導(dǎo)致的變異發(fā)生在第125位氨基酸由異亮氨酸(ATA)變成了甲硫氨酸(ATG)以及第302、341位氨基酸由甲硫氨酸(ATG)變成異亮氨酸(ATA / ATT)。第303、320位氨基酸，因密碼子第1、3位點(diǎn)同時(shí)突變，分別由纈氨酸(GTT)變成了異亮氨酸(ATC)、由亮氨酸(CTA)變成了異亮氨酸(ATC)。

表2 北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb氨基酸變異位點(diǎn)

注：HAP1～14為第1～14單倍型；E.谷氨酸，I.異亮氨酸，K.賴氨酸，L.亮氨酸，M.甲硫氨酸，P.苯丙氨酸，Q.谷氨酰胺，S.絲氨酸，V.纈氨酸.

2.3 遺傳多樣性及遺傳距離

北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因共計(jì)發(fā)現(xiàn)了14個(gè)單倍型。單倍型之間的遺傳距離為0.0009～0.1479，平均遺傳距離為0.0781。單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)、平均核苷酸差異數(shù)分別為0.8634、0.0671、76.1679。

根據(jù)遺傳距離構(gòu)建了北盤江下游尼羅羅非魚群體單倍型的鄰接法(圖2)、最大似然法(圖3)系統(tǒng)發(fā)育樹，兩種系統(tǒng)樹具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。該系統(tǒng)樹顯示，北盤江下游尼羅羅非魚群體可分為2個(gè)分支，其中一個(gè)分支包含8個(gè)單倍型共19個(gè)個(gè)體，另外一個(gè)分支含有6個(gè)單倍型19個(gè)個(gè)體。

圖2 基于遺傳距離構(gòu)建的北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因單倍型鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于遺傳距離構(gòu)建的北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因單倍型最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

3.1 Cytb基因序列和密碼子變異

由于蛋白質(zhì)功能上的需要和三聯(lián)體密碼子結(jié)構(gòu)的限制，DNA蛋白質(zhì)編碼區(qū)往往很少發(fā)生堿基缺失和插入[10]。本研究中，北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因序列未出現(xiàn)缺失或插入，其變異表現(xiàn)為堿基替換：轉(zhuǎn)換與顛換。在線粒體DNA進(jìn)化過程中，通常認(rèn)為發(fā)生轉(zhuǎn)換的頻率遠(yuǎn)高于發(fā)生顛換的頻率[11]。北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因共發(fā)現(xiàn)了116個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)、32個(gè)顛換位點(diǎn)、3個(gè)轉(zhuǎn)換與顛換共存位點(diǎn)(表1)，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)顯著多于顛換位點(diǎn)。理論上，DNA堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換有4種可能，發(fā)生顛換有8種可能，其堿基轉(zhuǎn)換概率與顛換概率的比值應(yīng)為0.5，然而由于堿基替換不是隨機(jī)發(fā)生的，以致實(shí)際上常常出現(xiàn)其比值大于0.5的“轉(zhuǎn)換偏差”[11]。在基因組的堿基替換變異中，DNA復(fù)制酶的嚴(yán)謹(jǐn)性、變異修復(fù)酶的保真性、堿基構(gòu)成及理化因素影響等都會(huì)影響堿基的變異[11]。盧松柏等[12]研究了蛋白編碼基因的四倍簡并位點(diǎn)，在排除結(jié)構(gòu)和功能上選擇壓力對(duì)突變的影響后，仍然發(fā)現(xiàn)四倍簡并位點(diǎn)存在著轉(zhuǎn)換對(duì)顛換的優(yōu)勢(shì)。用誘變劑處理大腸桿菌(Escherichiacoli)發(fā)現(xiàn)，誘變處理會(huì)導(dǎo)致更高的轉(zhuǎn)換比率[13]，由此推測(cè)轉(zhuǎn)換對(duì)顛換的優(yōu)勢(shì)可能還與體內(nèi)含有某些誘變劑有關(guān)。Meyer[14]認(rèn)為，在密碼子突變中以第3位點(diǎn)上的堿基變異最為常見，其中又以第3位點(diǎn)上的堿基轉(zhuǎn)換為最多，其次第3位點(diǎn)上顛換及第1位點(diǎn)上的轉(zhuǎn)換較多。本研究中，北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因密碼子第3位點(diǎn)堿基轉(zhuǎn)換、顛換位點(diǎn)分別為101個(gè)和31個(gè)，第1位點(diǎn)有14個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和1個(gè)顛換位點(diǎn)，而第2位點(diǎn)僅有1個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，這與Meyer[14]的結(jié)論一致。

北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因共有133個(gè)同義突變、9個(gè)非同義突變(表2)。其中，密碼子第1位點(diǎn)、第3位點(diǎn)堿基替換導(dǎo)致的非同義突變數(shù)占總突變數(shù)的比例分別為5/16、5/134，第2位點(diǎn)堿基只發(fā)生1個(gè)堿基轉(zhuǎn)換并引起了非同義突變。因此，該群體Cytb基因密碼子第1位點(diǎn)堿基變異導(dǎo)致的非同義突變數(shù)占總突變數(shù)的比例最高，而第3位點(diǎn)雖然發(fā)生堿基變異頻率最高，卻多為同義突變。

3.2 遺傳多樣性與入侵適應(yīng)潛力

在生物群體遺傳多樣性分析中，通常用單倍型的平均遺傳距離來衡量群體中個(gè)體間的遺傳變異程度，當(dāng)單倍型的平均遺傳距離大于0.01時(shí)，被認(rèn)為群體變異程度大[15]。本研究中，尼羅羅非魚單倍型的平均遺傳距離為0.0781，由此，該群體產(chǎn)生了較大的遺傳變異。同時(shí)，群體單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)的高低，也是評(píng)價(jià)一個(gè)生物群體遺傳多樣性水平的重要指標(biāo); 由于群體中mtDNA單倍型數(shù)小于群體樣品總數(shù)，所以在評(píng)價(jià)群體遺傳多樣性時(shí)核苷酸多樣性指數(shù)較單倍型多樣性指數(shù)更為可靠[16]。Grant等[17]認(rèn)為，如果群體核苷酸多樣性指數(shù)高于0.005并且單倍型多樣性指數(shù)高于0.5時(shí)，則該群體的遺傳多樣性較高。本研究中，北盤江下游尼羅羅非魚群體的核苷酸多樣性指數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)分別為0.0671、0.8634，表明該群體具有較高的遺傳多樣性。北盤江下游尼羅羅非魚群體核苷酸多樣性及單倍型多樣性高于珠江水系斑鱖(Sinipercascherzeri)7個(gè)地理群體(核苷酸多樣性指數(shù)0.0020，單倍型多樣性指數(shù)0.7730)[15]，也高于廣西奧利亞羅非魚那馬群體(核苷酸多樣性指數(shù)0.0007，單倍型多樣性指數(shù)0.4940)及武鳴養(yǎng)殖群體[18](核苷酸多樣性指數(shù)0.0009，單倍型多樣性指數(shù)0.6770)。北盤江尼羅羅非魚群體單倍型多樣性與Rognon等[19]研究的非洲自然種群(單倍型多樣性指數(shù)0.8846)相似，但核苷酸多樣性較非洲尼羅羅非魚自然種群(核苷酸多樣性指數(shù)0.0311)高。因此，北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因具有豐富的遺傳多樣性。

Grant等[17]指出，群體具有較高的核苷酸多樣性、較高的單倍型多樣性，說明該群體是由一個(gè)大而穩(wěn)定的種群經(jīng)過了較長的歷史演化而來或者由兩個(gè)不同系群發(fā)生二次接觸所致。西江上游尼羅羅非魚野生群體源于多年來本地區(qū)引種養(yǎng)殖尼羅羅非魚后逃逸至河流開放水體并自行擴(kuò)散。到目前為止，北盤江尚未開展尼羅羅非魚人工養(yǎng)殖，故該河流尼羅羅非魚群體應(yīng)源于西江上游紅水河尼羅羅非魚養(yǎng)殖逃逸群體。由于紅水河尼羅羅非魚養(yǎng)殖品系差異和逃逸時(shí)間不同等原因，加大了該河流尼羅羅非魚不同群系二次接觸的可能性，因而北盤江尼羅羅非魚群體具有豐富的遺傳變異。

物種遺傳多樣性的高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān); 物種遺傳多樣性越豐富，其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力就越大，遺傳多樣性為物種的適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力提供了潛在的遺傳基礎(chǔ)[20]。同時(shí)，遺傳多樣性還被認(rèn)為是決定外來種能否入侵成功的重要因素之一[4]。鑒于尼羅羅非魚在北盤江下游現(xiàn)已形成一定規(guī)模的野生種群[8-9]并具有豐富的種群遺傳多樣性，可見作為魚類外來種尼羅羅非魚在北盤江下游顯示了較強(qiáng)的入侵適應(yīng)潛力。

研究表明，進(jìn)行群體遺傳多樣性研究時(shí)，為了避免因人為取樣原因?qū)z傳多樣性研究結(jié)果造成影響，供試驗(yàn)的樣本量應(yīng)在30以上[21]。本研究中，北盤江尼羅羅非魚群體采樣的樣本量大于30，而且沿河捕撈采樣可以確保采樣過程中采集樣點(diǎn)涵蓋了北盤江下游全部河段。因此，本研究中，試驗(yàn)分析獲得的北盤江尼羅羅非魚群體遺傳多樣性參數(shù)和結(jié)果可信度高。