陳澈 喬海琦 周晟

(寧夏醫(yī)科大學(xué) 1中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2教務(wù)處教務(wù)科；3青島如一軟件有限公司)

糖尿病是一種慢性代謝紊亂性疾病，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟公布的最新數(shù)字，全球有約4.25億成年人患有糖尿病，2045年可能攀升至6.29億〔1〕。2型糖尿病作為糖尿病最常見的類型，是由多種基因遺傳及環(huán)境因素綜合導(dǎo)致的一組以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，具有多種程度的胰島素抵抗和胰島β細胞功能異?！?～4〕。研究表明2型糖尿病的作用機制涉及體內(nèi)物質(zhì)與能量的代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，且與多個系統(tǒng)密切相關(guān)〔5〕。

中醫(yī)藥治療2型糖尿病具有獨到的優(yōu)勢，可以通過調(diào)節(jié)人體臟腑功能、改善身體內(nèi)環(huán)境從而達到控制血糖、延緩并發(fā)癥的目的。玉液湯是治療消渴病的經(jīng)典名方，出自張錫純〔6〕《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由黃芪、葛根、雞內(nèi)金、知母、五味子、山藥、天花粉組成，具有補脾固腎、益氣養(yǎng)陰、生津止渴之功效。本課題組前期研究結(jié)果顯示〔7〕，玉液湯是臨床治療2型糖尿病的常用方劑，且其組成藥物多為中藥治療2型糖尿病的核心用藥。

以“玉液湯”為主題詞檢索中國知網(wǎng)，可看出玉液湯的研究主要集中在臨床應(yīng)用研究、文獻研究及相關(guān)動物實驗(圖1)，但從系統(tǒng)和整體角度對其降糖機制探討的研究尚有不足，其治療2型糖尿病的機制和關(guān)鍵環(huán)節(jié)點也尚不清楚。由于玉液湯組成藥物眾多，有效成分復(fù)雜，傳統(tǒng)的還原論方法研究并不能很好揭示多種生物分子網(wǎng)絡(luò)相互作用紊亂而引起的復(fù)雜疾病作用機制〔8〕。整合藥理學(xué)是將整體與局部、宏觀與微觀、藥物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過程與活性評價、計算與實驗相互結(jié)合，從多層次、多角度來研究多成分藥物與機體相互作用及其整合規(guī)律和作用機制的一門學(xué)科，已成為解析中藥復(fù)方體系之有效方法〔9〕。本文應(yīng)用整合藥理學(xué)，嘗試從整體和系統(tǒng)的角度探究玉液湯治療2型糖尿病的藥理機制和關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)。

圖1 玉液湯與2型糖尿病相關(guān)文獻可視化分析

1 材料與方法

1.1玉液湯化學(xué)成分篩選 以“葛根”、“黃芪”、“雞內(nèi)金”、“知母”、“山藥”、“天花粉”和“五味子”為關(guān)鍵詞在中藥整合藥理學(xué)V1.0版本中進行中藥化學(xué)成分的收集〔10〕。該平臺依據(jù)2015年版《中國藥典》、文獻信息及開源中藥數(shù)據(jù)庫，收錄了400余味常用中藥所含的13萬余個化合物成分信息以供檢索。

1.2中藥成分靶點預(yù)測 對藥物二維結(jié)構(gòu)進行相似性搜索，即采用中藥分子指紋，利用OpenBabel開源軟件提取化學(xué)指紋特征，并采用谷本系數(shù)定義的相似度計量方法，通過與美國食品藥品監(jiān)督管理局上市藥物進行相似性打分(score>0.8)獲取中藥成分作用靶標。

1.3疾病靶標預(yù)測 在中藥整合藥理學(xué)平臺V1.0中以“2型糖尿病”為關(guān)鍵詞檢索疾病靶點，該平臺整合了Drugbank數(shù)據(jù)庫、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)、人類表型本體數(shù)據(jù)庫(HPO)和藥物靶標數(shù)據(jù)庫(TTD)等資源，可對疾病相關(guān)基因和蛋白質(zhì)信息進行檢索。

1.4核心靶點篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于上述預(yù)測和篩選的中藥靶標和疾病靶標，建立“中藥靶標-疾病靶標”相互作用網(wǎng)絡(luò)。以節(jié)點度2倍的中位數(shù)為卡值，選取該網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點。此外，對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲性質(zhì)分析，將同時滿足“節(jié)點度”、“節(jié)點緊密度”和“節(jié)點介度”的中位數(shù)為卡值的節(jié)點選取，構(gòu)建玉液湯治療2型糖尿病的核心靶點網(wǎng)絡(luò)。其中連接度〔11〕為頂點關(guān)聯(lián)邊的數(shù)目，即該節(jié)點的鄰居數(shù)，該值越大，表示此節(jié)點越重要；緊密度〔12〕是指一個節(jié)點通過網(wǎng)絡(luò)到達另一個節(jié)點難易程度的指標，節(jié)點緊密度越高，則與其他節(jié)點的關(guān)系越近；介度〔13〕指在網(wǎng)絡(luò)中通過該節(jié)點的最短路徑數(shù)目，反映了節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的樞紐性，該值越大，說明這個節(jié)點的樞紐性越強。

1.5關(guān)鍵靶標功能預(yù)測與富集分析 針對核心靶標，同時查詢基因本體數(shù)據(jù)庫(GO)及京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)，對關(guān)鍵靶標進行基因功能分析和通路富集分析。根據(jù)P值大小，選取排名前30的通路，通過可視化方法構(gòu)建“中藥-成分-靶標-通路”多層網(wǎng)絡(luò)圖，進一步了解相關(guān)靶標功能，預(yù)測并解析玉液湯治療2型糖尿病的機制。

2 結(jié) 果

2.1玉液湯中所含成分及其預(yù)測靶標概況 玉液湯中7味中藥中共得到273個化學(xué)成分，其中葛根33個、黃芪29個、雞內(nèi)金2個、山藥61個、天花粉9個、五味子98個、知母41個。上述成分共預(yù)測到潛在作用靶標1 971個，其中葛根131個、黃芪230個、雞內(nèi)金27個、山藥1 091個、天花粉208個、五味子70個、知母214個。

2.2玉液湯中單味藥材之間的共有靶標情況 從表1中可以看出，除了每味中藥各自預(yù)測到的潛在靶標，7味中藥還存在共用靶標，即不同的中藥具有相同的作用靶標。其中黃芪-山藥、葛根-山藥、葛根-天花粉、天花粉-山藥、黃芪-知母、山藥-知母、雞內(nèi)金-山藥、雞內(nèi)金-天花粉的共同作用靶標均大于其自身作用靶標的一半以上，提示玉液湯治療2型糖尿病具有多成分-靶標、相互協(xié)同的治療特點。

表1 玉液湯單味中藥間共有靶標(靶標)

2.3玉液湯治療2型糖尿病的關(guān)鍵靶標分析 對藥物靶標和疾病靶標構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，共預(yù)測到核心靶標350個，其中潛在靶標148個，疾病已知靶標17個，藥物靶標與疾病共有靶標4個，其他靶標181個。將上述靶標進行“節(jié)點連接度”、“節(jié)點緊密度”和“節(jié)點介度”的網(wǎng)絡(luò)拓撲特征參數(shù)分析，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)值，選擇排名前10的網(wǎng)絡(luò)靶標，依次為磷脂酶Cδ(PLCD)1、葡萄糖激酶(GCK)、G蛋白亞基β1(GNB1)、核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶(ENPP)1、過氧化物酶體肉毒堿O-辛?；D(zhuǎn)移酶(CROT)、1型腺苷酸環(huán)化酶(AOCY1)、鈉/鉀轉(zhuǎn)運ATP酶亞基α-1(ATP1A1)、5′-AMP-活化蛋白激酶催化亞基α-1(PRKAA1)、細胞溶質(zhì)嘌呤5′-核苷酸酶(NT5C2)、DNA聚合酶epsilon亞基(POLE)4，其中PLCD1、GCK是連接度、緊密度最大的節(jié)點。見表2。查閱文獻發(fā)現(xiàn)PLCD1可參與脂質(zhì)降解與脂質(zhì)代謝，是維持代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵酶〔14〕。而GCK在糖代謝和調(diào)節(jié)胰島素分泌過程中發(fā)揮重要作用，可促進葡萄糖攝取與轉(zhuǎn)化〔15〕。

表2 玉液湯治療2型糖尿病的關(guān)鍵靶標名稱及其相關(guān)網(wǎng)絡(luò)拓撲特征參數(shù)值

2.4玉液湯治療2型糖尿病的核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，以“節(jié)點度”、“節(jié)點緊密度”和“節(jié)點介度”的中位數(shù)為卡值，選取同時滿足3個卡值的節(jié)點，并根據(jù)連接度的值顯示前100個核心靶點，構(gòu)建玉液湯治療2型糖尿病的候選靶標網(wǎng)絡(luò)，圖中節(jié)點的大小與連接度值呈正比關(guān)系，如圖2所示。圖中紅色代表藥物潛在作用靶標，共66個；黃色代表已知疾病靶標，共7個；綠色代表藥物與疾病共同靶標，共2個；灰色代表其他靶標，共25個。絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A催化亞基β(PPP2CB)和蛋白激酶Cβ(PRKCB)是藥物與疾病的共有靶標，PPP2CB可參與信號傳導(dǎo)與糖原代謝，從而調(diào)節(jié)血糖。PRKCB涉及多種細胞過程，參與胰島素信號傳導(dǎo)及脂肪細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運，在糖尿病發(fā)病中起重要作用〔16〕。此外，在圖中可以發(fā)現(xiàn)，藥物成分作用的靶標不僅可以直接作用于疾病靶點，還可以通過間接聯(lián)系而發(fā)生作用關(guān)系。如有些紅色、黃色、綠色的節(jié)點必須通過灰色節(jié)點作為樞紐才能建立連接，起到過渡的作用，亦是藥物干預(yù)疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

圖2 玉液湯治療2型糖尿病的候選靶標網(wǎng)絡(luò)示意圖

2.5核心靶標的功能分析和通路富集結(jié)果 通過對關(guān)鍵靶標進行基因功能分析，根據(jù)P值的大小列舉前20條功能信息，可以看出這些關(guān)鍵靶標涉及細胞質(zhì)、細胞質(zhì)膜、線粒體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)結(jié)合、PRK活性、蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、血小板活化、肽酰絲氨酸磷酸化、蛋白磷酸化、蛋白合成、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、凋亡過程的負調(diào)控等多個條目(表3)。推測2型糖尿病與細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝及生物合成等多個方面因素相關(guān)。進一步分析富集通路結(jié)果，得出20條關(guān)鍵通路，涉及多方面因素(表4)。不僅包括嘌呤代謝、核苷酸代謝等能量相關(guān)通路，神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等方面。此外，還涉及谷氨酸能突觸、細胞生長與死亡、雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、促性腺激素釋放激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、趨化因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、ErbB信號通路等作用環(huán)節(jié)。與此同時，還發(fā)現(xiàn)其與環(huán)境適應(yīng)、長期壓力、膠質(zhì)瘤、前列腺癌等方面也有相關(guān)關(guān)系。

表3 玉液湯治療2型糖尿病關(guān)鍵靶標具有的功能信息列表

表4 玉液湯治療2型糖尿病關(guān)鍵靶標所參與的通路信息列表

2.6玉液湯治療2型糖尿病“核心成分-關(guān)鍵靶標-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖 根據(jù)上述研究結(jié)果，構(gòu)建了玉液湯“中藥-成分-靶點-作用通路”可視化網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。

綠色代表中藥，紫色代表成分，藍色代表關(guān)鍵靶標，紅色代表通路圖3 中藥方劑治療疾病“核心成分-關(guān)鍵靶標-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

從圖中可以看出，玉液湯中共有86個活性成分，其中山藥含有19個、黃芪含有21個、知母含有28個、葛根含有7個、天花粉含有7個、雞內(nèi)金含有1個、五味子含有6個，其中黃芪-知母、山藥-黃芪-天花粉各有1個相同成分。這些成分共同作用于101個靶點及30條主要通路。除了涉及核苷酸代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)細胞生長與死亡、雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多個環(huán)節(jié)點，還與Rap1信號通路、膽堿能突觸、Ras信號通路、鈣信號通路、甲狀腺激素信號通路等有關(guān)。

3 討 論

2型糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”的范疇，中醫(yī)認為消渴多由于先天稟賦不足，或飲食不節(jié)、損傷脾胃、積熱內(nèi)蘊、化燥傷津，或勞欲所傷、腎陰虧損、虛火內(nèi)生所致，其病機主要在于陰津虧損，燥熱偏盛，治療上往往采取健脾益氣、清熱潤燥、固腎養(yǎng)陰等方法。2型糖尿病相關(guān)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞質(zhì)膜、線粒體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的負調(diào)控、氨基酸代謝、趨化因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、ErbB信號通路等相關(guān)代謝通路、信號通路及神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等方面均與2型糖尿病密切相關(guān)〔17～19〕。臨床研究顯示，玉液湯不僅可以改善臨床患者血糖，而且能降低三酰甘油、總膽固醇，并能發(fā)揮抗氧化、修復(fù)胰島β細胞作用〔17～19〕。

本研究的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，玉液湯在治療2型糖尿病的過程中，可作用于上文多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)點，且具有多成分多靶點的復(fù)雜作用機制。從本研究構(gòu)建的“玉液湯成分靶標-2型糖尿病靶標”的分子生物網(wǎng)絡(luò)及玉液湯“中藥-成分-靶標-通路網(wǎng)絡(luò)”中可看出，PLCD1、GNB1、GCK及ENPP1是網(wǎng)絡(luò)中較為重要的節(jié)點，PPP2CB和PRKCB是藥物和疾病共同靶點。相關(guān)研究文獻顯示〔20〕，GCK及ENPP1與胰島素抵抗顯著相關(guān)，能抑制胰島素作用，導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運信號及其在骨骼肌和脂肪中的利用率減少，當(dāng)減少GCK及ENPP1的表達，則可改善胰島素抵抗，而PLCD1、GCK、PPP2CB和PRKCB亦可通過調(diào)節(jié)糖脂代謝起到治療作用〔21，22〕。

對本研究構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)進行進一步分析可發(fā)現(xiàn)，五味子中有4個成分可以同時作用于PPP2CB和PRKCB，有2個成分能同時作用于GNB1；山藥中有2個成分能作用于PLCD1和GCK及ENPP1；黃芪和山藥可以共同作用于GCK。研究顯示〔23～25〕，五味子具有抗氧化和促進小鼠肝糖原合成的作用；黃芪能促進血漿胰島素和C肽分泌，且可以保護胰島功能和調(diào)節(jié)免疫功能紊亂；山藥能起到清除體內(nèi)氧自由基、減少過氧化脂質(zhì)合成的作用，且能提高葡萄糖耐受力〔26，27〕。結(jié)合本研究結(jié)果可以推測，玉液湯中的五味子、黃芪和山藥的相關(guān)成分或?qū)?型糖尿病的治療起到關(guān)鍵作用，且玉液湯中的多種化合物之間協(xié)同交叉作用于人體的多種靶標和通路，通過參與胰島素信號傳導(dǎo)、脂肪細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運、胰島素抵抗等多個過程產(chǎn)生了一個綜合的降糖機制。