辛凌翔,魏財(cái)文,張 媛,李 建,王秀麗,彭國(guó)瑞,張一幟,彭小兵,蔣玉文

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 海淀100081)

大腸桿菌,一方面是人和多種動(dòng)物腸道中的正常寄居菌,構(gòu)成腸道正常菌群的組成部分,具有重要的生理作用;另一方面,某些大腸桿菌可構(gòu)成致病菌,侵入機(jī)體后引發(fā)相應(yīng)的感染癥,如胃腸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎、傷口感染、敗血型感染、關(guān)節(jié)炎等[1]。多項(xiàng)研究表明,致病性的大腸桿菌與其O 抗原密切相關(guān),大腸桿菌的血清分型是以O(shè) 抗原為基礎(chǔ)的,不同致病性的大腸桿菌在O 抗原血清型上存在明顯差異[2-3]。因此,大腸桿菌菌株O 抗原的血清型鑒定對(duì)大腸桿菌的病原學(xué)研究及流行病學(xué)調(diào)查等方面具有重要意義。但是,我國(guó)現(xiàn)有的大腸桿菌O 抗原定型血清制備工藝較為粗糙,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)鑒定時(shí)非特異性交叉凝集素較多,不能保證準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,產(chǎn)品質(zhì)量與生產(chǎn)工藝有待進(jìn)一步提升與改良[4]。本課題組擬從大腸桿菌O抗原定型血清的制備入手,以期提高此類(lèi)產(chǎn)品對(duì)大腸桿菌血清型鑒定的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸桿菌參考菌株CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163),由中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康家兔,體重1.5~2.0 kg,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基及試劑 普通肉湯、普通瓊脂、硫乙醇酸鹽、酪胨、葡萄糖蛋白胨湯、含0.5%石碳酸生理鹽水,購(gòu)自北京中海動(dòng)物保健科技公司。大腸桿菌O 抗原定型血清、180 種大腸桿菌菌體微量凝集試驗(yàn)抗原,由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細(xì)菌制品檢測(cè)室提供。

1.4 主要儀器設(shè)備 GNP-9270 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱,購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。THZ-C 型恒溫振蕩器,購(gòu)自太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。Herasafe KS 生物安全柜,購(gòu)自德國(guó)Heraeus 公司。離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司。

1.5 方法

1.5.1 免疫抗原的制備 將大腸桿菌CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163)株凍干菌種接種普通肉湯培養(yǎng)基復(fù)壯后,劃線(xiàn)接種普通瓊脂平皿,37 ℃培養(yǎng)24 h 后,取單菌落接種普通肉湯100 mL,37 ℃200 r/min 培養(yǎng)16 h 后,121 ℃高壓1 h,待其恢復(fù)室溫后,按0.1%加入甲醛溶液,置2 ℃~8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 動(dòng)物的免疫及定型原血清的制備 取20 只健康家兔,每種免疫抗原注射4 只并進(jìn)行分組編號(hào)。1~4 號(hào)兔為O26 血清型組,注射大腸桿菌O26 抗原;5~8 號(hào)兔為O153 血清型組,注射大腸桿菌O153 抗原;9~12 為O157 血清型組,注射大腸桿菌O157 抗原;13~16 號(hào)兔為O159 血清型組,注射大腸桿菌O159 抗原;17~20 號(hào)兔為O163 血清型組,注射大腸桿菌O163 抗原。采用兔的耳緣靜脈注射法,各組分別免疫抗原共計(jì)4 次,每次免疫間隔7 d,免疫劑量分別為1 mL、2 mL、3 mL、4 mL。終免后第7 天,對(duì)免疫兔進(jìn)行心臟采血,收集新鮮血液于采血管中。所有采集血液先于37 ℃靜置2 h,再置于2 ℃~8 ℃保存,使血清充分析出。 將血液以4 000 r/min 離心15 min,收集血清作為定型原血清,按0.01%(V/V)加入硫柳汞溶液,置2 ℃~8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 血清凝集素的測(cè)定 通過(guò)微量凝集試驗(yàn)的方法,使用U 型96 孔板,取血清80 μL 與抗原80 μL反應(yīng)。將各血清分別與180 種大腸桿菌菌體微量凝集試驗(yàn)O 抗原逐一反應(yīng),以確定該血清與非特異性抗原的交叉凝集素。孔底出現(xiàn)白色扣狀沉積為陰性,即血清與抗原不凝集;反之,未出現(xiàn)白色扣狀沉積為陽(yáng)性,即血清與抗原凝集;若孔底白色扣狀沉積與凝集顆粒同時(shí)出現(xiàn),結(jié)果判為可疑。

1.5.4 血清凝集價(jià)的測(cè)定 在U 型96 孔板中加入等量的血清原液與含0.5%石碳酸生理鹽水,然后依次進(jìn)行對(duì)倍稀釋,每行設(shè)非特異性凝集的抗原與血清反應(yīng)作為陽(yáng)性對(duì)照。振蕩均勻后蓋上板蓋,放置于濕盒中,于51 ℃反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)完成后,對(duì)光觀察結(jié)果。以出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)作為該血清與抗原的凝集價(jià)。

1.5.5 血清吸收抗原的制備 選用凝集價(jià)最高的非特異性抗原的生產(chǎn)菌株制備吸收抗原。取凍干菌種分別接種普通肉湯復(fù)蘇,37 ℃靜置培養(yǎng)20 h,劃線(xiàn)接種普通瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)20 h。從平板上挑取光滑圓整菌落分別密集劃線(xiàn)接種普通瓊脂中管斜面數(shù)支,37 ℃培養(yǎng)24 h。每支中管斜面培養(yǎng)物用0.5%石炭酸生理鹽水洗下,分別混合置分裝瓶中,121 ℃高壓1 h 后作為吸收抗原,待其恢復(fù)室溫后置2 ℃~8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.6 定型血清的吸收與制備 將待吸收血清用0.5%石炭酸生理鹽水進(jìn)行5 倍稀釋后,按20%(V/V)加入吸收抗原,置37 ℃200 r/min 吸收3 h,然后置2 ℃~8 ℃繼續(xù)吸收至少24 h,3 000 r/min 離心15 min 后吸取上清,即為吸收過(guò)的血清。

若定型原血清被選取制備好的吸收抗原第一次吸收,則該血清為一次吸收后血清,吸收抗原為一次吸收抗原;若定型原血清被兩種抗原先后吸收,則制備的血清為二次吸收后血清,吸收抗原分別為一次吸收抗原和二次吸收抗原。

每次吸收后,通過(guò)微量凝集試驗(yàn)方法,測(cè)定待檢血清與非特異性抗原的交叉凝集情況。若非特異性交叉凝集情況已完全消除,則該血清可直接制備為定型血清;若待檢血清仍與部分非特異性抗原發(fā)生交叉凝集,但凝集價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其與特異性抗原的凝集價(jià),則將血清進(jìn)行適當(dāng)稀釋至非特異性交叉凝集完全消除,再制備成定型血清;若待檢血清仍與部分非特異性抗原發(fā)生交叉凝集,且凝集價(jià)和該血清與特異性抗原的凝集價(jià)接近,則需再次選取吸收抗原并進(jìn)行交叉凝集素的吸收,直至無(wú)法繼續(xù)吸收及稀釋,制備出定型血清。

1.5.7 定型血清質(zhì)量評(píng)價(jià) 將制備好的定型血清過(guò)濾除菌后按1%(V/V)加入1%硫柳汞溶液。采用微量凝集試驗(yàn)方法進(jìn)行特異性檢查及效價(jià)測(cè)定。符合要求的血特異性血清定量分裝至玻璃瓶中,1 mL/瓶,置2 ℃~8 ℃保存。

2 結(jié)果

本研究首先按照大腸桿菌定型原血清制備的方法,以大腸桿菌參考菌株CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163)為菌種制備免疫抗原,并用免疫抗原免疫家兔,從而獲得了5 種定型原血清。通過(guò)微量凝集試驗(yàn)的方法,將定型原血清分別與180 種微量凝集試驗(yàn)抗原逐一反應(yīng),明確各定型原血清與凝集抗原的凝集價(jià),通過(guò)制備吸收抗原對(duì)血清進(jìn)行吸收及稀釋的方法消除非特異性凝集,制備成大腸桿菌O 抗原定型血清。具體試驗(yàn)結(jié)果如下:

2.1 定型原血清的制備 按照定型原血清制備工藝,每種免疫抗原免疫4 只家兔。免疫CVCC3739(O159)抗原的家兔有1 只(14 號(hào)家兔)在加強(qiáng)免疫后死亡,予以淘汰,不做后續(xù)研究,其余免疫抗原的家兔均存活。由此制備了O26、O153、O157、O159、O163 共5 種血清型的大腸桿菌菌體O 抗原定型原血清。

2.2 定型原血清吸收抗原的選取 試驗(yàn)結(jié)果表明,不同定型原血清與非特異性抗原交叉凝集情況不盡相同,即使同一血清型組的不同家兔制備出的定型原血清與非特異性抗原反應(yīng)的交叉凝集素?cái)?shù)量也相差較大。因此本試驗(yàn)中,同一血清型組中選取與凝集抗原反應(yīng)數(shù)量最少的定型原血清,并測(cè)定其與凝集抗原發(fā)生凝集的效價(jià)。若與待檢血清發(fā)生交叉凝集效價(jià)最高的非特異性抗原,同時(shí)也是同一血清型組其他血清的交叉凝集素,則選用該抗原的生產(chǎn)菌株制備這一組原血清的吸收抗原(表1)。

表1 定型原血清與抗原的微量凝集試驗(yàn)結(jié)果

由表1 可以看出,O26、O153、O157、O159、O163血清型組分別選取2 號(hào)、5 號(hào)、11 號(hào)、15 號(hào)、17 號(hào)原血清進(jìn)行進(jìn)一步凝集價(jià)的測(cè)定。與2 號(hào)、5 號(hào)、11號(hào)、15 號(hào)、17 號(hào)原血清發(fā)生交叉凝集的效價(jià)最高的非特異性抗原分別為O154、O155、O56、O107、O127。另外,O154、O155、O56、O107、O127 同時(shí)也分別為同一血清型組內(nèi)其他血清的交叉凝集素。因此,選取O154、O155、O56、O107、O127 抗原的生產(chǎn)菌株分別制備O26、O153、O157、O159、O163 血清型組內(nèi)的各個(gè)定型原血清的吸收抗原。

2.3 定型原血清第一次吸收后的凝集情況 吸收抗原O154 吸收O26 血清型組的1~4 號(hào)血清,吸收抗原O155 吸收O153 血清型組的5~8 號(hào)血清,吸收抗原O56 吸收O157 血清型組的9~12 號(hào)血清,吸收抗原O107 吸收O159 血清型組的13、15、16 號(hào)血清,吸收抗原O127 吸收O163 血清型組的17~20號(hào)血清。吸收后,再通過(guò)微量凝集試驗(yàn)的方法,測(cè)定能與一次吸收后血清發(fā)生凝集的抗原及凝集效價(jià)(表2)。

2.4 定型血清的制備 本研究采用吸收與稀釋相結(jié)合的方法制備了5 種大腸桿菌菌體O 抗原定型血清,并將制備好的定型血清效價(jià)稀釋至1∶2,置于2 ℃~8 ℃保存?zhèn)溆谩＞唧w制備方法如下。

2.4.1 O26 定型血清制備方法的確定 將O26 血清型的1~4 號(hào)血清均用O154 抗原吸收后,一次吸收后血清1~4 號(hào)與O26 抗原的凝集價(jià)為210至211,此外吸收后的1~4 號(hào)血清與部分非特異性抗原發(fā)生交叉凝集,但凝集價(jià)遠(yuǎn)低于其與特異性抗原的凝集價(jià)。則將一次吸收后血清1~4 號(hào)混合后,按512(29)倍稀釋,至非特異性交叉凝集情況完全消除,制備成O26 定型血清。

2.4.2 O153 定型血清制備方法的確定 將O153血清型的5~8 號(hào)血清均用O155 抗原吸收后,一次吸收后血清5~8 號(hào)與O153 抗原的凝集價(jià)為28至210。此外,吸收后的5~8 號(hào)血清與O155 抗原的凝集價(jià)為28至210,6~8 號(hào)血清與O48 抗原的凝集價(jià)均為29至210。由于一次吸收后的5 號(hào)血清只與1 種非特異性抗原(O155)發(fā)生交叉凝集且凝集價(jià)接近其與特異性抗原的凝集價(jià),而6~8 號(hào)血清與2 種非特異性抗原(O155、O48)發(fā)生交叉凝集且凝集價(jià)接近其與特異性抗原的凝集價(jià),故而淘汰6~8 號(hào)血清。

由于5 號(hào)血清一次吸收后,與特異性抗原O153反應(yīng)的凝集價(jià)和與非特異性抗原O155 反應(yīng)的凝集價(jià)接近,且O155 已經(jīng)為5 號(hào)血清第一次吸收的抗原,則不需選取吸收抗原再次進(jìn)行交叉凝集素的吸收。遂將一次吸收后血清5 號(hào),按128(27)倍稀釋,至僅剩余1 種非特異性交叉凝集素(O155)未消除,制備成O153 定型血清。

表2 一次吸收后血清與抗原的微量凝集試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 O157 定型血清制備方法的確定 將O157血清型的9~12 號(hào)血清均用O56 抗原吸收后,一次吸收后血清9~12 號(hào)與O157 抗原的凝集價(jià)為28至29。此外,吸收后的9~12 號(hào)血清與O115 抗原的凝集價(jià)也為28至29。由于第一次吸收后的9~12 號(hào)血清仍與1 種非特異性抗原(O115)發(fā)生交叉凝集且凝集價(jià)接近其與特異性抗原的凝集價(jià),則選取O115 為9~12 號(hào)血清的二次吸收抗原,進(jìn)行定型血清的二次吸收。隨后,通過(guò)微量凝集試驗(yàn)的方法,測(cè)定能與二次吸收后血清發(fā)生凝集的抗原及凝集效價(jià)(表3)。

由于第二次吸收后的9~12 號(hào)血清仍與O115非特異性抗原發(fā)生交叉凝集且凝集價(jià)接近其與特異性抗原O157 的凝集價(jià),這與第一次吸收后的凝集情況一致,但就凝集效價(jià)來(lái)說(shuō)較第一次吸收后的相比大大降低。因此,不考慮進(jìn)行該血清型組的二次吸收。將用O56 吸收抗原一次吸收后的9~12號(hào)血清混合后,按256(28)倍稀釋,至僅剩余1 種非特異性交叉凝集素(O115)未消除,制備成O157 定型血清。

表3 O157 血清型組二次吸收后血清與抗原的微量凝集試驗(yàn)結(jié)果

2.4.4 O159 定型血清制備方法的確定 將O159血清型的13、15、16 號(hào)血清均用O107 抗原吸收后,一次吸收后血清13、15、16 號(hào)與O159 抗原的凝集價(jià)為210至211。此外,吸收后的13、15、16 號(hào)血清與部分非特異性抗原發(fā)生交叉凝集,但凝集價(jià)遠(yuǎn)低于其與特異性抗原的凝集價(jià)。則將一次吸收后血清13、15、16 號(hào)混合后,按128(27)倍稀釋,至非特異性交叉凝集情況完全消除,制備成O159 定型血清。

2.4.5 O163 定型血清制備方法的確定 由表2 可知,將O163 血清型的17~20 號(hào)血清均用O127 抗原吸收后,吸收后的9~12 號(hào)血清與O163 抗原反應(yīng)的凝集價(jià)為20至22。試驗(yàn)結(jié)果表明,吸收后血清與抗原發(fā)生凝集的凝集價(jià)不但接近,而且其與特異性抗原的凝集價(jià)表現(xiàn)為較低水平。綜合以上結(jié)果,不考慮選取吸收抗原進(jìn)行該血清型組交叉凝集素的吸收,而是直接采用血清原液稀釋的方法制備定型血清。通過(guò)微量凝集試驗(yàn)的方法,測(cè)定能與17~20 號(hào)原血清發(fā)生凝集的抗原及具體凝集效價(jià)(表4)。

由于17~20 號(hào)原血清與特異性抗原O163、非特異性抗原O41 及O127 的凝集價(jià)較高但卻接近,即將17~20 號(hào)原血清按512(29)倍稀釋,至剩余2種非特異性交叉凝集素(O41、O127)未消除,制備成O163 定型原血清。

2.5 定型血清質(zhì)量評(píng)價(jià) 大腸桿菌菌體O 抗原定型血清性狀為無(wú)色澄明液體;無(wú)菌生長(zhǎng);O26、O159 定型血清特異性良好,為單因子定型血清,O153、O157、O163 定型血清特異性較為良好,有1~2 種非特異性交叉凝集素,為定型血清(表5)。

表5 定型血清質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

大腸桿菌的抗原較為復(fù)雜,主要包括菌體抗原(O 抗原)、表面抗原(K 抗原)和鞭毛抗原(H 抗原)。除了O 抗原以外,其余抗原并不一定在同一菌株上同時(shí)表達(dá)。即使是同一抗原,由于化學(xué)組成不同及結(jié)構(gòu)不同,可導(dǎo)致不同菌株在免疫學(xué)方面所表現(xiàn)出不同的抗原特異性,所以同一種抗原又可分為若干個(gè)血清型[5]。因此,在免疫血清學(xué)上將大腸桿菌劃分為不同的血清型菌株,在實(shí)際工作中可用血清學(xué)方法進(jìn)行大腸桿菌的血清型鑒定。大量研究表明,不同血清型的大腸桿菌的致病性存在較大差異,所以對(duì)大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定進(jìn)而明確該菌株的病原學(xué)意義顯得尤為重要[6]。由于病原性大腸桿菌菌株與O 抗原關(guān)系密切,且O 抗原為大腸桿菌血清分型的基礎(chǔ),因而對(duì)大腸桿菌O 抗原的鑒定比另外兩種抗原的鑒定顯得更為重要[7]。

大腸桿菌的O 抗原位于細(xì)胞壁的最外層。其細(xì)胞壁由外壁層和肽聚糖組成,外壁層又由脂多糖、外膜和脂蛋白構(gòu)成。脂多糖位于細(xì)胞壁的最外層,由脂類(lèi)A、核心多糖和特異性多糖構(gòu)成。其中,特異性多糖為脂多糖的最外層,即為大腸桿菌菌體O 抗原的主要成分,決定了大腸桿菌的抗原性。O抗原是由若干低聚糖重復(fù)單位構(gòu)成的多糖鏈,由于低聚糖的組成和數(shù)量不同、低聚糖單位間的聯(lián)接鍵不同等因素導(dǎo)致了O 抗原的多樣性[8]。目前,已知的大腸桿菌有180 種不同結(jié)構(gòu)的O 抗原,這些O 抗原具有較好的免疫原性,免疫動(dòng)物即可獲得高效價(jià)的相應(yīng)的抗血清。但是,由于構(gòu)成低聚糖的單糖的合成酶基因具有較高的同源性,導(dǎo)致不同大腸桿菌O 抗原血清型的抗血清之間存在交叉凝集[9]。

大腸桿菌的抗血清主要是用不同大腸桿菌的抗原分別免疫動(dòng)物而獲得的。通過(guò)免疫家兔制備相應(yīng)的抗血清是最為常用的方法?？寡逄禺愋粤己门c否決定了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性,所以探索制備出特異性良好的大腸桿菌抗血清具有重要意義[10-11]。制備特異性較好的抗血清的過(guò)程中,吸收是消除抗血清非特異性凝集的經(jīng)典而有效的方法,另外,稀釋的方法也常被應(yīng)用到細(xì)菌抗血清的制備中。本研究采用吸收與稀釋相結(jié)合的方法以消除制備的大腸桿菌O 抗原定型抗血清的非特異性凝集,從而獲得特異性較好的定型血清。

本研究以大腸桿菌參考菌株CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163)為菌種,利用大腸桿菌定型原血清制備的方法,微量凝集試驗(yàn)的方法,對(duì)抗血清吸收和稀釋的方法等,最終確定了5 種大腸桿菌O 抗原定型血清制備方法,為提高大腸桿菌血清型鑒定的準(zhǔn)確性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。但在試驗(yàn)過(guò)程中仍遇一些問(wèn)題,如制備的O153、O157、O163 定型血清非單因子定型血清,均有不同數(shù)量的交叉凝集素?zé)o法徹底清除,O157 血清型組第二次吸收后血清與第一次吸收后血清的凝集效價(jià)相比普遍降低等。鑒于以上結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)室日后將進(jìn)一步改良制備工藝,從而制備出特異性?xún)?yōu)良的大腸桿菌O 抗原定型血清。