楊明凡,高 航,萬(wàn) 博,李慶華,陳紅英,張紅英,夏平安

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州450002;2.河南德鄰生物制品有限公司,河南 新鄉(xiāng)453521)

大腸桿菌可引起人和多種動(dòng)物的腸道內(nèi)或腸道外感染,導(dǎo)致腸炎和敗血癥等癥狀,是人獸共患病的主要病原。引起人和動(dòng)物發(fā)病的大腸桿菌主要有三大類:腸致病性大腸桿菌(EPEC)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)和腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)。其中引起生長(zhǎng)豬發(fā)病的大腸桿菌主要是ETEC,臨床上主要是引起幼畜腹瀉和腸毒血癥等。人感染該病原菌可引起腹瀉和出血性腸炎,此外還可引起溶血性尿毒綜合征等,嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。

大腸桿菌主要是通過(guò)消化道感染為主要傳播途徑的病原菌。牛、羊、豬、家禽等是其主要的宿主,該菌可通過(guò)動(dòng)物傳染給人,也可由人傳染給人,或環(huán)境中的大腸桿菌通過(guò)污染水、食物等間接的傳染給人,引起人的感染發(fā)病[1-2]。因此對(duì)動(dòng)物源性大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定、生物學(xué)特性研究及有效藥物控制的研究就顯得尤為重要,從而為有效防控大腸桿菌感染提供理論參考[3-4]。

近些年來(lái),隨著抗生素和化學(xué)抗菌藥物的廣泛使用,細(xì)菌的耐藥菌株不斷增加,并呈現(xiàn)出多重耐藥性,導(dǎo)致臨床上治療細(xì)菌感染的疾病時(shí)常常得不到有效的控制,造成治療失敗,并且抗生素和化學(xué)抗菌藥物有很大的毒副作用[5]。中藥根據(jù)中藥理論進(jìn)行組方,每種中藥又有多種有效成分,具有毒副作用小,無(wú)耐藥性、無(wú)殘留的特點(diǎn),在臨床治療上顯示獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)選用傳統(tǒng)的白頭翁湯對(duì)分離的豬源大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌和體內(nèi)的治療試驗(yàn),為臨床上大腸桿菌病的治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2017 年4 月-2017 年12 月,對(duì)河南省6 個(gè)不同的地區(qū)的豬場(chǎng)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的病豬進(jìn)行采樣,無(wú)菌采集豬的脾臟、腎臟、肝臟、淋巴結(jié)等共48 份樣品,放低溫冰盒中,送實(shí)驗(yàn)室待處理。

1.2 主要試劑 LB 肉湯、麥康凱、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基,購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;微量生化鑒定管,購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌O 抗原定型血清,購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;PCR TaqMix 聚合酶、DL-2 000 DNA Marker,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;白頭翁、黃柏、黃連、秦皮等,購(gòu)自鄭州市張仲景大藥房。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1 月齡小鼠,35 只,體重20 g 左右,雌雄各半,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 白頭翁湯的制備 白頭翁湯由白頭翁、黃柏、黃連、秦皮等藥材(經(jīng)鑒定均符合中華人民共和國(guó)獸藥典(2015 年版))。按比例加入水,浸泡30 min,大火煮沸,水開后再用文火維持沸騰30 min,使藥物的濃度為1 g/mL,待溫時(shí)過(guò)濾去渣,取藥液備用。

1.5 病原菌的分離 將無(wú)菌采集的脾臟、腎臟、肝臟、淋巴結(jié)等病料接種在LB 培養(yǎng)基上增菌培養(yǎng),然后分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上,挑取紅色光滑濕潤(rùn)的菌落接種在LB 培養(yǎng)基上,然后再分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上,挑取黑色帶金屬光澤的菌落做純培養(yǎng),并進(jìn)行革蘭染色,鏡檢。

1.6 分離菌生化試驗(yàn) 將分離的純菌株分別接種微量生化鑒定管中進(jìn)行生化試驗(yàn),主要包括糖類發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基化試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)和尿素酶試驗(yàn)等。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn) 經(jīng)生化試驗(yàn)鑒定為大腸桿菌的分離菌株分別接種于LB 培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h,調(diào)整菌液濃度OD600nm值為1。取培養(yǎng)物0.2 mL,經(jīng)口服途徑給試驗(yàn)的小鼠接種,每株菌接種5 只小鼠為一組,同時(shí)用同量的無(wú)菌LB 液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照。接種后取24~48 h 死亡的小鼠的脾臟和肝臟,按照1.5 的方法分離細(xì)菌,并進(jìn)行革蘭染色,鏡檢。

1.8 血清型鑒定 參考馬增軍等的O 抗原鑒定方法測(cè)定分離菌株的血清型。

1.9 毒力基因PCR 擴(kuò)增 參考GenBank 公布的大腸桿菌eaeA 基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1-5′-GGCACAAGCATAAGCGC-3′,P2-5′-CCTGCAGCAACGAGGCA G-3′。引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。以分離株細(xì)菌DNA 為模板PCR 擴(kuò)增目的基因,退火溫度為54 ℃。

1.10 白頭翁湯對(duì)分離菌株的體外抑菌試驗(yàn) 采用試管法檢測(cè)白頭翁湯的MIC[10]。將分離菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基內(nèi),37 ℃培養(yǎng)24 h,調(diào)整菌液濃度OD600nm值為1。取制備好的白頭翁湯藥液,用LB 培養(yǎng)基按倍比法稀釋10 個(gè)稀釋度,然后每只試管分別接種20 μL 的分離菌液,同時(shí)設(shè)置不加白頭翁湯的陽(yáng)性對(duì)照和不加菌液的白頭翁湯陰性對(duì)照,37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果。

1.11 臨床治療 用制備好的白頭翁湯給臨床發(fā)病的仔豬灌服,每頭豬每天1 次,每次30 mL,連用7 d,同時(shí)用氟苯尼考作為治療對(duì)照組,氟苯尼考的用量按照使用說(shuō)明書推薦量使用。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的形態(tài)及培養(yǎng)特征 分離菌經(jīng)革蘭染色鏡檢,觀察到革蘭陰性、短小桿菌。分離細(xì)菌在麥康凱培養(yǎng)基上均呈粉紅色、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的小菌落(見(jiàn)中插彩版圖1);在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上均呈黑色帶金屬光澤的菌落(見(jiàn)中插彩版圖2)。

圖1 大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上菌落

圖2 大腸桿菌在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上菌落

2.2 生化試驗(yàn) 6 株分離菌株能夠分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖和L-阿拉伯糖,產(chǎn)酸產(chǎn)氣;吲哚試驗(yàn)為陽(yáng)性、甲基化試驗(yàn)為陽(yáng)性、V-P 試驗(yàn)為陰性、硫化氫試驗(yàn)為陰性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陰性和尿素酶試驗(yàn)為陰性。

2.3 動(dòng)物試驗(yàn) 6 株分離菌株接種于小鼠后10~48 h 內(nèi)全部死亡,對(duì)照組小鼠均健康存活。并從死亡的小鼠體內(nèi)分離到革蘭陰性短小桿菌,在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈粉紅色菌落,在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上呈黑色帶金屬光澤的菌落。

2.4 血清型鑒定 玻片凝集試驗(yàn)顯示從48 株分離株中,定型菌株6 株,分別為O8有1 株、O64有2 株、O157有3 株。

2.5 PCR 擴(kuò)增 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,在紫外燈下觀察結(jié)果并拍照,結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.6 白頭翁湯對(duì)分離菌株的體外抑菌試驗(yàn) 用白頭翁湯對(duì)分離的6 株大腸桿菌進(jìn)行MIC 測(cè)定,結(jié)果顯示,白頭翁湯對(duì)分離菌株MIC 均為0.625 mg/mL、MBC 均為1.25 mg/mL。

2.7 臨床治療 用白頭翁湯治療臨床上的25 頭發(fā)病仔豬,同時(shí)設(shè)另外20 頭發(fā)病仔豬用氟苯尼考做對(duì)照,結(jié)果白頭翁湯組治愈24 頭,治愈率96%;氟苯尼考組治愈14 頭,治愈率70%。

圖3 PCR 擴(kuò)增大腸桿菌eaeA 基因

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)細(xì)菌分離、顯微鏡觀察、生化鑒定、血清型鑒定及PCR 擴(kuò)增,從6 個(gè)不同地區(qū)采集的48 份樣品中分離鑒定出6 個(gè)大腸桿菌菌株,血清型鑒定結(jié)果來(lái)看O8有1 株、O64有2 株、O157有3 株,O157為主要致病性血清型在我國(guó)也多見(jiàn)報(bào)道。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示,6 株分離菌均為強(qiáng)毒株。PCR 擴(kuò)增顯示,這6 株大腸桿菌分離株均含有產(chǎn)生大腸桿菌粘附毒素的eaeA基因,為進(jìn)一步研究大腸桿菌的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

大腸桿菌對(duì)抗生素的產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象普遍存在[6-7],王秀梅報(bào)道受試的18 種大腸桿菌分離菌株90%以上的細(xì)菌對(duì)磺胺甲噁唑、四環(huán)素和氯霉素耐藥[2]。中藥具有綠色、安全、無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),發(fā)揮功效是由多種成分入藥共同作用,臨床上應(yīng)用又多為復(fù)方,隨癥加減,比較經(jīng)典的“白頭翁湯”即如此。白頭翁湯出自漢代·張仲景《傷寒論》,由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮4 味藥物組成。本方具有清熱解毒,涼血止痢,抗菌消炎等功效,歷來(lái)被醫(yī)家認(rèn)為是治熱毒血痢的首選藥方。本試驗(yàn)通過(guò)體外MIC 測(cè)定表明白頭翁湯對(duì)分離大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑菌作用。臨床治療試驗(yàn)表明,白頭翁湯對(duì)該病有顯著的治療效果,從而為臨床上治療豬源大腸桿菌提供了依據(jù)。