任靜，郝燕，白耀棟，朱燕芳，張思成

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院林果花卉研究所，甘肅 蘭州 730070；2.白龍江林業(yè)管理局河西綜合開發(fā)局，甘肅 高臺 734300；3.蘭州市紅古區(qū)經(jīng)濟作物技術(shù)推廣站，甘肅 蘭州 730080)

葡萄(Vitisvinifera)種植面積和產(chǎn)量僅次于柑橘，是世界第2大水果，也是我國主栽果樹之一[1].其中，釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，是葡萄發(fā)展不可或缺的一部分[2].中國河西走廊釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)以得天獨厚的地理資源優(yōu)勢成為葡萄酒原料的最適宜產(chǎn)區(qū)[3-4].‘貴人香’(Italian Riesling，IR)是該區(qū)釀造干白和冰白葡萄酒的主要品種，其產(chǎn)量高、品質(zhì)好和營養(yǎng)價值高[5].但是，該產(chǎn)區(qū)冬季較為寒冷，出現(xiàn)持續(xù)低溫或劇烈降溫，春寒和凍害頻繁發(fā)生等情況嚴重制約了‘貴人香’釀酒葡萄的生產(chǎn)，為了葡萄順利越冬，必須‘埋土防寒’，但該方式成本高且費時費力[6].將優(yōu)良的釀酒葡萄品種嫁接在抗凍性強的葡萄砧木上，可以不用埋土或少埋土使得葡萄越冬，減少埋土造成對枝條和根系的破壞，同時還可節(jié)省時間和成本.因此，利用抗寒性強的葡萄做砧木進行‘貴人香’釀酒葡萄營養(yǎng)系嫁接，篩選抗寒性較強的嫁接苗，是目前緩解和防止河西釀酒葡萄越冬凍害的有效措施之一.

鑒定葡萄砧穗組合的抗凍性，可以為抗凍釀酒葡萄的推廣和生產(chǎn)提供科學的理論依據(jù)，因此果樹抗寒性的綜合評價是抗性育種的重要內(nèi)容之一[7].前人研究表明，相對電導率、丙二醛含量、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量等指標與抗寒性有密切的關系[8].由于果樹的抗寒性是多個數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀綜合作用的結(jié)果，單一指標評價葡萄抗寒性是片面的[9]，用多個指標進行綜合性評價才是科學、準確的[10].曹建東等[11]通過模擬低溫處理,對7個葡萄砧木的電導率、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸和丙二醛含量與抗寒性的關系進行研究，并通過主成分分析對不同葡萄品種的抗寒性進行了綜合評價.施明等[12]利用主成分分析法，確定了8個釀酒葡萄品種的抗寒性強弱.王依[13]利用主成分分析法對4種釀酒葡萄的抗寒性進行評價.袁軍偉等[14]測定11個葡萄品種根系的自由水、褐變指數(shù)等，結(jié)合主成分分析法對其進行聚類.目前，利用主成分分析評價葡萄抗寒性僅僅是集中于單個葡萄砧木或葡萄品種上，通過主成分分析結(jié)合聚類分析，并利用相關性分析對對葡萄砧穗組合的抗寒性進行綜合評價少見報道.

因此，本研究在前人的研究基礎上，模擬低溫脅迫環(huán)境，通過測定‘貴人香’7個葡萄砧穗組合的抗寒性相關指標，利用主成分分析法、聚類分析法和相關性分析綜合評價不同葡萄砧穗組合的抗寒性強弱，以期篩選出河西走廊‘貴人香’釀酒葡萄生產(chǎn)抗寒性強的砧穗組合.

1 材料與方法

1.1 試驗園概況

試驗園位于甘肅省高臺縣祁連釀酒葡萄基地，N 39°03′50″，E 98°57′27″，處于河西走廊中部，黑河中游下段.境內(nèi)光照充足，溫差大，干旱少雨；年均氣溫7.4 ℃，年日照時數(shù)3 118.3 h，全年無霜期150 d，年均降水量103 mm，蒸發(fā)量2 000 mm.土壤為沙質(zhì)土，土層深厚，質(zhì)地疏松，通透性好，導熱性較高，利于排水，pH為8.15[15].

1.2 材料

2012年將‘貴人香(Italian Riesling，IR)’與‘5BB’‘5C’‘420’‘3309C’‘101-14MG’‘110R’‘1103P’(即為IR/5BB、IR/5C、IR/420、IR/3309C、IR/101-14MG、IR/110R、IR/1103P)7個砧木品種的砧穗組合進行嫁接處理，進行常規(guī)露地栽培管理.2016年采集長勢良好且均勻一致的一年生休眠枝條，于0～10 ℃沙藏貯存.

1.3 方法

1.3.1 材料低溫處理 2016年12月15日，第1步：將采回的一年生枝條用蒸餾水沖洗干凈，再用剪刀將粗度一致的枝條每4～6節(jié)剪成一段，每個砧木品種3份，每份12～16段；第2步：先將蠟置于電熱板上融化，再用蠟把枝條兩端剪口密封，最后用保鮮膜和紗布將枝條包裹置于多波段低溫培養(yǎng)箱(北京雅士林試驗設備有限公司(GDJW-225型))中進行低溫處理.試驗處理溫度分別為-15、-20、-25、-30、-35 ℃，從4 ℃(CK)開始，以4 ℃/h速率(每降低1 ℃保持15 min)降至處理溫度，在處理溫度下保持12 h，然后以4 ℃/h速率(每升高1 ℃保持15 min)升至4 ℃，保持8 h.以4 ℃貯藏的枝條為對照，每個處理重復3次.

1.3.2 測定指標 相對電導率參照王文舉[16]：相對電導率(REC)=R1/R2×100%；丙二醛(MDA)：硫代巴比妥酸(TBA)法；可溶性蛋白(SP)：考馬斯亮藍G-250染色法[17]；游離脯氨酸(Pro)：茚三酮比色法[18]；可溶性糖(SS)：蒽酮比色法[19].

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行處理并作圖；利用SPSS 22.0軟件采用Duncan多重比較進行顯著性方差分析，P<0.05為差異顯著；采用SPSS 22.0進行描述性分析，再進行主成分分析和聚類分析.利用R語言軟件采用Pearson作相關性分析，并作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫對各葡萄砧穗組合枝條抗寒性指標的影響

由圖1-A可知，隨處理溫度降低，各砧穗組合的相對電導率總體呈‘降低-升高-降低’的變化趨勢.其中IR/110R、IR/1103P和IR/420的相對電導率在4～-15 ℃處理期間急劇下降，當溫度為-15 ℃時，IR/420的相對電導率降至最低，為55.61%；溫度在-15～-20 ℃處理期間，IR/101-14MG、IR/5C、IR/110R、IR/5BB和IR/1103P的相對電導率緩慢升高，IR/420的相對電導率在-20 ℃時急劇增加，是-15 ℃處理下的1.49倍；在-20～-30 ℃處理期間，IR/3309C和IR/101-14MG的相對電導率急劇增加，且IR/101-14MG在-30 ℃時出現(xiàn)峰值，為101.65%，比4 ℃下增加了0.30倍，而IR/5C的相對電導率緩慢升高；各砧穗組合的相對電導率在-30～-35 ℃處理期間急劇下降，IR/110R比其它組合下降較快.

由圖1-B可知，各砧穗組合的丙二醛含量隨處理溫度降低呈‘降低-升高-降低’的變化.IR/3309C、IR/101-14MG、IR/5C、IR/110R、IR/5BB、IR/1103P和IR/420的丙二醛含量在4～-15 ℃處理期間呈緩慢下降趨勢，IR/1103P的降幅最大，比4 ℃下的降低了47.69%；在-15～-35 ℃處理期間，IR/3309C、IR/5C、IR/101-14MG的丙二醛含量變化平穩(wěn)，先上升后下降.在-15～-25 ℃處理期間，IR/420、IR/1103P、IR/110R、IR/5BB的丙二醛含量急劇升高，其中IR/420在-25 ℃處理下最高，為9.05 nmol/g；在-25～-35 ℃處理期間，4個砧穗組合的丙二醛含量急劇下降，其中IR/110R的丙二醛含量均低于其他砧穗組合，在-35 ℃時降至最低，為1.85 nmol/g，相比于4 ℃下降低了56.84%.

由圖1-C可知，各砧穗組合的游離脯氨酸含量隨處理溫度降低表現(xiàn)為‘降低-升高-降低’.在4～-25 ℃處理期間，IR/3309C的游離脯氨酸緩慢降低，在-25～-35 ℃處理期間，其急劇升高，且在此期間均高于其他砧穗組合，在-35 ℃時最高，為39.95 μg/g，是4 ℃下的1.89倍.在4～-20 ℃處理期間，除了IR/3309C，其他砧穗組合均急劇下降，且IR/1103P降低幅度最大，比4 ℃下降低了87.66%.在-15～-35 ℃處理期間，IR/5BB、IR/110R、IR/1103P的游離脯氨酸含量變化幅度較小，且緩慢上升，其中IR/110R的游離脯氨酸含量在-15 ℃時為最低，為4.81 μg/g，比4 ℃下降低了86.86%.在-20～-25 ℃處理期間，IR/420、IR/101-14MG、IR/5C的游離脯氨酸含量急劇升高，分別比-20 ℃提高了3.28倍、2.11倍和2.31倍.

圖1 不同低溫對各葡萄砧穗組合抗寒性指標的影響Figure 1 The influence of low temperature on cold resistance indexes of different grape stock-scion combinations

由圖1-D可知，各砧穗組合的可溶性糖含量隨處理溫度降低表現(xiàn)為‘升高-降低-升高’.各砧穗組合的可溶性糖含量在4～-15 ℃時均急劇升高，其中IR/5C砧木可溶性糖含量在4 ℃時最低，為3.55%，而IR/101-14MG在-15 ℃時最高，為9.22%，比4 ℃下增加了0.49倍；各砧穗組合的可溶性糖含量在-15～-20 ℃緩慢降低，在-20～-25 ℃均急劇升高，IR/5BB在-25 ℃時出現(xiàn)峰值，為10.61%；IR/3309C、IR/101-14MG、IR/5C、IR/110R和IR/5BB的可溶性糖含量在-25～-35 ℃處理間均急劇降低，相比于-25 ℃，在-35 ℃分別降低了26.60%、38.55%、26.90%、30.81%和33.08%，而IR/1103P和IR/420的可溶性糖含量則緩慢降低.

由圖1-E可知，各砧穗組合的可溶性蛋白含量隨處理溫度降低總體呈先降后升的變化趨勢.在4～-15 ℃時，IR/3309C、IR/110R、IR/5BB、IR/1103P和IR/420可溶性蛋白含量緩慢降低，而IR/101-14MG和IR/5C緩慢升高；在-15～-25 ℃時，各砧穗組合的可溶性蛋白含量急劇下降，IR/3309C可溶性蛋白含量在-25 ℃時降至最低，為0.31 mg/g，相比于4 ℃，降低了68.63%；在-25～-35 ℃時，各砧穗組合的可溶性蛋白含量均升高，IR/3309C的急劇升高，相比于-25 ℃，在-35 ℃下增加了1.70倍.

2.2 抗寒性綜合評價

主成分的特征值和貢獻率是選擇主成分的依據(jù)，主成分碎石圖可以用來確定最優(yōu)的主成分數(shù)目，橫坐標表示主成分數(shù)目，縱坐標表示特征值，主成分特征值的連線陡峭部分即為應取的主成分數(shù)目.本試驗中，經(jīng)過主成分分析將7個葡萄砧穗組合的5個與抗寒性有關的葉片指標進行了轉(zhuǎn)化，根據(jù)特征值大于1和方差貢獻率最優(yōu)的主成分數(shù)，由圖2可知，前2個主成分的特征值較大，連線較為陡峭，由提取2個主成分最合適，提取其累積方差貢獻率為76.93%，綜合了大部分信息.第1主成分特征值為2.733，貢獻率為54.659%(表1)，電導率和可溶性蛋白的載荷值和得分系數(shù)均高于其他指標(表2).第2主成分特征值為1.114，貢獻率為22.277%(表1)，丙二醛和可溶性糖含量的載荷值和得分系數(shù)均高于其他指標(表2).

每個主成分所對應的特征值占所提取主成分總的特征值之和的比例作為權(quán)重,計算7個葡萄砧穗組合的綜合主成分值作為綜合得分.7個葡萄砧穗組合的抗寒性有強到弱的順序為：IR/1103P>IR/5BB>IR/420>IR/110R>IR/5C>IR/101-14MGMG>IR/3309C(表3).

圖2 主成分分析碎石圖Figure 2 Screen plot of PCA (principal component analysis)

因子Component初始特征根 Initial eigenvalues特征值Eigenvalues貢獻率/%Contribution rate累積貢獻率/%Cumulative contribution rate12.73354.65957.65921.11422.27776.935

表2 7個葡萄砧穗組合抗寒性的主成分載荷矩陣

表3 7個葡萄砧穗組合抗寒性2個主成分綜合得分及其排名

2.3 聚類分析

將7個葡萄砧穗組合的相關指標做聚類分析，聚類方法采用Ward法.由圖4可以看出，7個組合可分為3類.第Ⅰ類為IR/3309C、IR/101-14MG，抗寒性最弱；第Ⅱ類為IR/5C、IR/420、IR/110R，抗寒性次之；第Ⅲ類為IR/5BB、IR/1103P，抗寒性最強.用主成分分析法得出的結(jié)論與聚類分析所得結(jié)果相一致.

圖3 聚類分析譜系圖Figure 3 Dendrogram of HCA (hierarchical cluster analysis)

2.4 相關性分析

為了進一步研究5個抗寒性指標間的協(xié)同變異程度，對7個不同砧穗組合的相對電導率、丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖及主成分綜合得分進行了相關性分析.由圖4可以看出，綜合得分F與REC(0.75)、MDA(0.77)、Pro(-0.78)和SP(0.71)4個指標之間的相關系數(shù)(r)均達到了極顯著水平，說明可以用主成分綜合得分來代表其他4個指標，綜合評價葡萄砧穗組合抗寒性的大小.

F：綜合得分；REC：相對電導率；MDA：丙二醛；Pro：脯氨酸；SP：可溶性蛋白；SS：可溶性糖.黑色圓圈代表顯著正相關，白色圓圈代表顯著負相關，圓圈大小代表顯著性大小，分別于左下角的數(shù)字對應.Black dircels repesent a significant positive correlation,white circles repressent a significant nagutive correlation,circles size represent significant size and corresponds to the number in the lower left corner.圖4 7個葡萄砧穗組合抗寒指標間的相關性分析Figure 4 Correlative analysis of indices for 7 grape scion-stock combinations cold resistance

3 討論

本試驗在測定‘貴人香’7個葡萄砧穗組合的相對電導率、丙二醛、游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等抗寒指標的基礎上，利用主成分分析法綜合評價得出河西走廊葡萄砧穗組合IR/1103P抗寒性較強.本研究的開展，為進一步篩選出河西走廊‘貴人香’抗寒性強的葡萄砧穗組合奠定基礎.

相對電導率是鑒定果樹抗寒性的重要指標之一[20-21].本研究表明，隨處理溫度降低，7個砧穗組合的電導率呈先降后升再降的趨勢，電導率下降可能是由于砧穗組合受凍害較輕，膜透性增加程度較小，易于恢復；電導率均上升，可能是由于受凍害嚴重，細胞膜透性大大增加，導致不能恢復.在4～-15 ℃處理期間，IR/110R、IR/1103P、IR/420的電導率急劇下降，可能是由于植株通過凍融循環(huán)，保持原有性質(zhì).IR/101-14MG、IR/5C、IR/110R、IR/5BB、IR/1103P的電導率緩慢上升，表明在此溫度脅迫下，砧穗組合有保持細胞膜完整性的能力，與張連杰等[22]的4個葡萄砧木相對電導率變化結(jié)果相符合.在-20～-30℃處理期間，IR/3309C、IR/101-14MG的電導率急劇升高，IR/101-14MG達峰值，表明低溫脅迫使得體內(nèi)膜流動性明顯降低，通透性增加，造成細胞內(nèi)溶質(zhì)外滲[23].在-30～-35 ℃處理期間，各砧穗組合的電導率含量降低，可能是由于強低溫脅迫，植株體內(nèi)細胞的質(zhì)膜受到不可逆的損傷，電解質(zhì)外滲已達極限，植株為了進一步抵御低溫脅迫，可能觸發(fā)了質(zhì)膜Ca2+-ATPase，以維持細胞內(nèi)Ca2+水平的動態(tài)平衡，使得電導率下降[24].

在低溫條件下，丙二醛與細胞膜損壞程度有關[25].本研究發(fā)現(xiàn)，隨處理溫度降低，各葡萄砧穗組合丙二醛含量呈降-升-降的趨勢，說明不同砧穗組合受到低溫脅迫時，體內(nèi)活性氧代謝平衡發(fā)生變動，其氧化過程增強，對細胞膜造成了損傷.在-15～-25 ℃處理期間，IR/3309C、IR/5C、IR/101-14MG的丙二醛含量緩慢上升，IR/420、IR/1103P、IR/5BB、IR/110R的則急劇升高，由此可知不同砧穗組合在低溫脅迫時膜脂過氧化程度不同，且對于低溫的響應程度不用，與謝麗芬等[26]在6個引種葡萄的MDA含量明顯增加研究結(jié)果一致.在-25～-35 ℃處理期間，IR/420、IR/1103P、IR/5BB、IR/110R的丙二醛含量急劇下降，可能是砧穗組合對于強低溫脅迫的一個響應敏感區(qū)域，忍受低溫的臨界點.IR/420在-25℃處理下的丙二醛含量最高，可見該砧穗組合的細胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞的較為嚴重[27].

游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的積累，有助于抗寒性的提高[28].本研究中，隨著脅迫溫度的降低，‘貴人香’7個葡萄砧穗組合的游離脯氨酸呈降-升-降的趨勢.在4～-15 ℃處理期間，各砧穗組合可能為了響應脅迫，產(chǎn)生抗性蛋白，抵御脅迫，脯氨酸作為蛋白質(zhì)的組成成分而降低.在-25～-35 ℃處理期間，IR/3309C的脯氨酸含量急劇升高，顯著高于其他砧穗組合；在-15～-35 ℃處理期間，IR/5BB、IR/110R、IR/1103P的脯氨酸含量緩慢上升；在-20～-25 ℃處理期間，IR/420、IR/101-14MG、IR/5C的脯氨酸含量急劇升高，表明脯氨酸的積累可能是為了促進植株體內(nèi)蛋白質(zhì)的水合作用，增大親水面積，緩解低溫傷害[29]，這與王淑杰[30]和艾琳[31]的研究結(jié)果相似.與此同時，不同砧穗組合對于低溫脅迫的響應溫度不同，這可能是由于組合的親和性與砧木的品種有關，IR/5BB、IR/110R、IR/1103P的脯氨酸變化緩慢，可見對低溫脅迫的適應能力較強，而IR/3309C對于低溫脅迫的反應最為強烈，可知該組合對于低溫的適應能力較差.同時在4～-20 ℃處理期間，除了IR/3309C，其他砧穗組合均急劇下降，且IR/1103P降低幅度最大，表明IR/1103P在低溫脅迫初期，已經(jīng)啟動了防御體系，協(xié)調(diào)細胞氧化還原勢的生理生化作用，激發(fā)對低溫的適應性反應[32].

在植物體內(nèi)，可溶性糖提高，可以降低水勢，增加保水能力，從而使冰點下降，提高植物抗寒能力[33].本研究中，在4～-15 ℃時，各砧穗組合的可溶性糖含量均急劇升高，表明在低溫脅迫初期，植物體內(nèi)通過積累可溶性糖，可能是通過糖代謝相關的代謝途徑形成保護性位置，以便提高抗性[34].其中IR/101-14MG在-15 ℃時最高，表明該砧穗組合的響應程度較大，且受脅迫程度較其他組合深.在-15～-20 ℃時，各砧穗組合的可溶性糖含量緩慢降低，表明各組合通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的代謝途徑，慢慢適應脅迫.在-20～-25 ℃時，各砧穗組合的可溶性糖含量急劇升高，可見該低溫脅迫，再次打破代謝平衡，產(chǎn)生更多的糖緩沖細胞質(zhì)的過度脫水，保護體內(nèi)原生質(zhì)膠體不至遇冷凝固[35].

可溶性蛋白的含量與植物的抗冷性之間存在密切關系，且在低溫脅迫下，其含量增加[36].本研究中，隨著脅迫溫度的降低，各砧穗組合的可溶性蛋白呈先降后升的變化趨勢.在4～-15 ℃時，IR/3309C、IR/110R、IR/5BB、IR/1103P和IR/420可溶性蛋白含量緩慢降低，表明砧穗組合為了適應低溫脅迫，體內(nèi)的可溶性蛋白束縛水分，減少原生質(zhì)，防止細胞結(jié)冰；而IR/101-14MG和IR/5C緩慢升高，可能體內(nèi)可溶性蛋白不夠用，通過可溶性蛋白質(zhì)的增加提高抗性.在-15～-25 ℃時，各砧穗組合的可溶性蛋白含量急劇下降，在此低溫脅迫期間，可能是由于植株體內(nèi)蛋白質(zhì)降解速率加強或合成變緩.在-25～-35 ℃時，各砧穗組合的可溶性蛋白上升，其中IR/3309C急劇升高，表明由于強低溫的誘導，各砧穗組合體內(nèi)可能產(chǎn)生了胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白、抗凍蛋白、保護其他酶類的蛋白質(zhì)等與提高植物抗寒性、保護細胞免受凍害的功能性蛋白質(zhì)，建立平衡，進而使得可溶性蛋白含量的上升[37].

但是，抗寒性僅用單一指標很難評價[38].因此，結(jié)合主成分分析、聚類分析和相關性分析綜合評價抗寒性強弱，既全面，又準確.主成分分析中第1主成分電導率和可溶性蛋白的載荷值和得分系數(shù)最高，第2主成分丙二醛和可溶性糖含量的載荷值和得分系數(shù)最高，說明這四個指標是葡萄砧穗組合抗寒性的首要響應指標，也可作為河西走廊葡萄砧穗組合抗寒性強弱鑒定的生化指標.本試驗中葡萄砧穗組合的抗寒性由強到弱為IR/1103P>IR/5BB>IR/420>IR/110R>IR/5C>IR/101-14MG>IR/3309C.高登濤[39]在引入石河子地區(qū)的5個葡萄砧木抗寒性比較一文中研究表明其葡萄砧木抗寒性5BB>5C>420A>110R.高振[40]在對葡萄砧木和栽培品種抗寒性的評價結(jié)果表明在山東抗寒性5BB>110R>3309C>1103P.本試驗與前人研究結(jié)果有所不同，可能是由于接穗與砧木之間相互作用、生長環(huán)境以及嫁接親和性均對葡萄砧穗組合的抗寒性產(chǎn)生影響[41-43].聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果相一致，根據(jù)二者之間的共性，第Ⅰ類為IR/3309C、IR/101-14MG，抗寒性最弱；第Ⅱ類為IR/5C、IR/420、IR/110R，抗寒性次之；第Ⅲ類為IR/5BB、IR/1103P，抗寒性最強.綜上可知，在河西走廊葡萄產(chǎn)區(qū)，IR/5BB和IR/1103P砧穗組合適宜推廣栽植.