王璞，馬旭洲，溫旭

（上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心/水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），又稱大閘蟹或河蟹，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda）甲殼綱（Crustacea）十足目（Decapoda）方蟹科（Grapsidae）絨螯蟹屬（Eriocheir），是我國重要的水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物[1]，以肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)效益好等優(yōu)點(diǎn)受到廣大養(yǎng)殖戶的青睞。近年來，隨著人工育苗技術(shù)的推廣，人工苗種產(chǎn)量逐漸增加，2017年全國中華絨螯蟹苗種產(chǎn)量已達(dá)843 890 kg[2]。溫度是影響甲殼動(dòng)物生長發(fā)育的重要環(huán)境因素之一[3]，一直是科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。目前，已對(duì)合浦絨螯蟹（Eriocheir hepuensis）卵和幼體發(fā)育的生長適溫[4]，絨螯近方蟹（Hemigrapsus penicillatus）胚胎和幼體發(fā)育的積溫[5]，梭子蟹（Portunus trituberculatus）、鋸緣青蟹（Scylla serrata）胚胎發(fā)育溫度[6-7]等進(jìn)行了研究。

有效積溫法則是溫度與發(fā)育關(guān)系的直觀體現(xiàn)[8]，生物學(xué)零度和有效積溫是甲殼動(dòng)物的重要生物學(xué)指標(biāo)，不僅可以衡量水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)環(huán)境溫度變化的響應(yīng)，而且可為水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物人工育苗的溫度調(diào)控、發(fā)育歷期提供重要參考。

中華絨螯蟹的整個(gè)生命周期分為胚前、胚胎和胚后3個(gè)發(fā)育階段，其中胚后發(fā)育階段又包括幼體、仔蟹、幼蟹和成蟹4個(gè)時(shí)期，幼體期（包括Ⅰ～Ⅴ期溞狀幼體和M期大眼幼體）是中華絨螯蟹胚后發(fā)育的起始時(shí)期，對(duì)整個(gè)胚后階段的健康發(fā)育具有決定性作用。目前，關(guān)于中華絨螯蟹生長發(fā)育溫度的研究主要集中在胚胎發(fā)育階段和胚后發(fā)育階段的幼蟹時(shí)期，如不同水溫對(duì)中華絨螯蟹胚胎發(fā)育階段的影響[9]、中華絨螯蟹胚胎階段有效積溫和酶的關(guān)系[10]、河蟹早繁育苗胚胎發(fā)育積溫的調(diào)控[11]、中華絨螯蟹幼蟹時(shí)期積溫與生長的關(guān)系[12]等；但關(guān)于幼體時(shí)期生物學(xué)零度和有效積溫的研究尚未見報(bào)道。

本研究擬采用室內(nèi)水族箱培育和室外溫度監(jiān)測相結(jié)合的方式，定期觀察、記錄溫度和發(fā)育歷期數(shù)據(jù)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，探討中華絨螯蟹溞狀幼體的生物學(xué)零度、有效積溫和發(fā)育歷期并進(jìn)行驗(yàn)證，以期為中華絨螯蟹人工育苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于江蘇省鹽城市射陽縣黃三水產(chǎn)苗種培育有限公司（33°52′3.79″N，120°27′12.12″E），該基地?fù)碛屑s46.67萬m2天然海水人工生態(tài)育苗池塘，同時(shí)配有標(biāo)準(zhǔn)檢測實(shí)驗(yàn)室。生態(tài)育苗池塘為注入天然海水的人工土池，規(guī)格統(tǒng)一為長45.0 m、寬30.0 m、塘深3.0 m，育苗期水深為1.5～2.0 m。

1.2 供試幼體

本實(shí)驗(yàn)幼體為隨機(jī)采集的1 800只長江水系河蟹良種“江海21”Ⅰ期溞狀幼體（由江蘇省鹽城市射陽縣黃三水產(chǎn)苗種培育有限公司提供），幼體健康，活力旺盛。

1.3 生物學(xué)零度和有效積溫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2016年4月9日進(jìn)行育苗塘抱卵蟹掛籠，然后每隔2 h進(jìn)行采樣觀察，以Ⅰ期溞狀幼體孵化超過60%為蟹苗取樣時(shí)間。向9個(gè)經(jīng)過消毒、容量為15 L，規(guī)格為40.0 cm×28.5 cm×16.5 cm的水族箱內(nèi)各注入10 L經(jīng)60目篩絹過濾的育苗池塘水，用DTC-120溫度控制器（徐州歐詣電器有限公司）設(shè)置3個(gè)恒溫處理組，分別為20、22和24℃，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。各箱均放入隨機(jī)取樣的中華絨螯蟹Ⅰ期溞狀幼體200只，以LP-40型RESUN超靜音增氧泵（深圳市興日生實(shí)業(yè)有限公司）進(jìn)行微充氧，以保證實(shí)驗(yàn)期間水體溶氧量不低于5 mg/L。

另取水族箱6個(gè)，分別加入7.5 L育苗池塘水，分為3組，環(huán)境條件設(shè)置與處理組一致。以備換水使用。

生物學(xué)零度和有效積溫實(shí)驗(yàn)歷經(jīng)22 d。每天8：00和17：00按照《河蟹生態(tài)養(yǎng)殖》（第2版）[1]進(jìn)行投喂，其中：Ⅰ期溞狀幼體投喂小球藻，發(fā)育至Ⅱ期溞狀幼體時(shí)開始投喂輪蟲，發(fā)育至Ⅴ期溞狀幼體時(shí)開始投喂鹵蟲。每天6：00進(jìn)行吸污，每2天換水一次，每次換水5 L，吸污和換水采用SC-002型換水器（廣東博宇水族實(shí)業(yè)有限公司）。每天6：00、10：00、16：00和20：00進(jìn)行觀察，使用YSI550A便攜式溶氧儀（美國YSI公司）監(jiān)測溶氧和實(shí)時(shí)水溫，并按照《河蟹生態(tài)養(yǎng)殖》（第2版）[1]所述方法觀察河蟹溞狀幼體外觀以判斷發(fā)育期，記錄各處理的發(fā)育情況，確認(rèn)每次變態(tài)達(dá)到60%的時(shí)間點(diǎn)。取4次溫度的平均值為該處理組當(dāng)日的發(fā)育平均溫度，取實(shí)驗(yàn)期內(nèi)該處理組所有日期發(fā)育平均溫度的平均值為該處理組發(fā)育平均溫度。

1.4 歷史監(jiān)測數(shù)據(jù)

由于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室恒溫條件下設(shè)計(jì)的，所以為了增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性，采用基地歷史監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行比較?；貧v史數(shù)據(jù)監(jiān)測時(shí)間為2012—2016年每年的4月和5月，在射陽實(shí)驗(yàn)基地隨機(jī)選取4口育苗塘，每口育苗塘四角及中央處各插入一根竹竿，用防水材料固定一臺(tái)RC-4溫度記錄儀（江蘇省精創(chuàng)電氣股份有限公司）在竹竿上，用皮套固定外置傳感器，記錄水面下100 cm處的水溫，設(shè)置記錄間隔為15 min。實(shí)驗(yàn)塘餌料參照《河蟹生態(tài)養(yǎng)殖》（第2版）[1]，結(jié)合育苗實(shí)際情況投喂。于每天6：00、10：00、16：00和20：00進(jìn)行4次觀察，記錄各發(fā)育期天數(shù)。在M期大眼幼體變態(tài)完成時(shí)回收溫度記錄儀，取其中Ⅰ期溞狀幼體變態(tài)60%至大眼幼體變態(tài)60%的數(shù)據(jù)作為基地歷史監(jiān)測數(shù)據(jù)。

1.5 監(jiān)測指標(biāo)

記錄室內(nèi)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)各處理、各重復(fù)的日平均溫度、幼體時(shí)期的各發(fā)育天數(shù)。歷史監(jiān)測數(shù)據(jù)記錄育苗期每年日平均溫度、幼體階段的各發(fā)育天數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)計(jì)算

根據(jù)有效積溫法則K=N(T－C)[13]，借助最小二乘法推導(dǎo)出室內(nèi)生物學(xué)零度和有效積溫實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算公式：

式中：K為有效積溫，℃·d；N為溞狀幼體發(fā)育需要的時(shí)間，d；T為發(fā)育期平均水溫，℃；C為生物學(xué)零度，℃；V為發(fā)育速率（V=1/N）；n為處理組數(shù)，本實(shí)驗(yàn)處理組數(shù)為3。

歷史監(jiān)測數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)中有效積溫的計(jì)算方法為：首先將2012—2016年每年室外生態(tài)育苗塘育苗期的平均溫度和發(fā)育歷期數(shù)據(jù)代入式（1），計(jì)算出每年的生物學(xué)零度，然后將2012—2016年每年室外育苗塘各期平均溫度、各期發(fā)育天數(shù)代入式（2）中，計(jì)算出各期有效積溫，再利用公式進(jìn)行加和，獲得當(dāng)年育苗期總有效積溫。式中：K1為幼體Ⅰ期發(fā)育有效積溫，Kn為幼體第n期發(fā)育有效積溫，以此類推，∑K為各期發(fā)育有效積溫的累積值，即當(dāng)年育苗期總有效積溫。

1.7 數(shù)據(jù)處理方法

利用Excel 2010軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，利用SPSS 19.0軟件對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用最小顯著性差異法（least significant difference,LSD）對(duì)不同處理和不同年份的樣本平均數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析，置信區(qū)間為95%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

將3個(gè)處理的發(fā)育時(shí)間和平均水溫代入公式（1）和（2）中，得出生物學(xué)零度為6.91℃，有效積溫為274.18 ℃·d

從3個(gè)處理的發(fā)育時(shí)間、平均水溫及有效積溫的計(jì)算結(jié)果（表1）可以看出，溫度對(duì)中華絨螯蟹幼體的發(fā)育天數(shù)有明顯影響，中華絨螯蟹幼體的發(fā)育天數(shù)隨著溫度的升高明顯縮短。對(duì)幼體時(shí)期有效積溫進(jìn)行驗(yàn)算，將上面計(jì)算所得的生物學(xué)零度6.91℃代入式（2），并進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果表明，3個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度組驗(yàn)算結(jié)果顯示有效積溫的平均值為274.18℃，與實(shí)驗(yàn)計(jì)算結(jié)果274.18℃一致，且各實(shí)驗(yàn)溫度組間差異均不顯著（P＞0.05）（表1）。

使用歷史監(jiān)測數(shù)據(jù)計(jì)算2012—2016年自然溫度條件下各發(fā)育期有效積溫和當(dāng)年各發(fā)育期的有效積溫之和，可見各個(gè)相鄰發(fā)育期的有效積溫比較接近（表2）。

表1 3個(gè)處理的發(fā)育歷期、平均水溫及有效積溫Table 1 Development period,average water temperature and effective accumulated temperature of three treatments

表2 2012—2016年自然溫度條件下各發(fā)育期有效積溫Table 2 Effective accumulated temperature of each period under natural temperature condition from 2012 to 2016 ℃

將生物學(xué)零度C=6.91℃代入有效積溫驗(yàn)算公式K=N(T－C)，對(duì)2012—2016各年有效積溫進(jìn)行驗(yàn)算，并與室內(nèi)實(shí)驗(yàn)有效積溫?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異均不顯著（P＞0.05）（表3）。綜上表明，中華絨螯蟹溞狀幼體階段的生物學(xué)零度為6.91℃，有效積溫為274.18℃·d。

表3 2012—2016年自然溫度條件下有效積溫計(jì)算及差異顯著性分析結(jié)果Table 3 Calculation of effective accumulated temperature under natural temperature condition and results of significant difference analysis from 2012 to 2016

3 討論與結(jié)論

3.1 與其他相近研究的異同點(diǎn)

生物學(xué)零度和有效積溫研究在農(nóng)林業(yè)上應(yīng)用較廣，相近研究均遵循有效積溫法則，如用于昆蟲的病害防治[14]，確定植物種子萌發(fā)及陸生、水生變溫動(dòng)物的發(fā)育期研究等。在農(nóng)林業(yè)方面，研究了梨小食心蟲（Grapholitha molesta）發(fā)育全世代的生物學(xué)零度和有效積溫[15]，探討了粵東6種菊科植物種子的生物學(xué)零度、有效積溫和各自萌發(fā)歷期對(duì)溫度的響應(yīng)[16]。水生變溫動(dòng)物生物學(xué)零度和有效積溫研究通常根據(jù)對(duì)象、環(huán)境、用途的不同，設(shè)計(jì)研究周期、范圍并選擇其生活史中單獨(dú)或者相鄰階段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如：對(duì)光棘球海膽（Strongylocentrous nudus）的研究選擇了從受精卵發(fā)育至棱柱幼體階段[17]，對(duì)中華鋸齒米蝦（Neocaridina denticulate sinensis）的研究選擇了從受精卵發(fā)育至幼蝦孵化階段[18]，對(duì)三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）和背瘤麗蚌（Lamprotula leai）的研究選擇了從鉤介幼蟲發(fā)育至稚蚌階段[19-20]，而對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）的研究則選擇了溞狀幼體和糠蝦幼體階段[21]。

3.2 幼體階段有效積溫、生物學(xué)零度和發(fā)育歷期特點(diǎn)

由歷史監(jiān)測數(shù)據(jù)可見，每年孵化初期水溫偏低，導(dǎo)致Ⅰ期溞狀幼體所需發(fā)育積溫較之Ⅱ期至Ⅲ期溞狀幼體略高，Ⅱ期溞狀幼體至大眼幼體期的有效積溫均隨幼體發(fā)育期的增加而呈逐漸上升趨勢(shì)。黃曉榮等對(duì)中華絨螯蟹胚胎發(fā)育積溫做了初步研究[10]，陳軍偉等在黃曉榮等的研究基礎(chǔ)上推算出中華絨螯蟹胚胎階段生物學(xué)零度為5℃[12]，低于本文的幼體階段生物學(xué)零度，說明生物學(xué)零度隨發(fā)育階段而上升。洪萬樹等發(fā)現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期溞狀幼體和MⅠ、MⅡ、MⅢ期糠蝦幼體生物學(xué)零度間無顯著差異[21]?？梢姡环N生物相鄰發(fā)育時(shí)段的生物學(xué)零度差別極?。槐疚难芯拷Y(jié)果與此相近。

3.3 幼體階段影響生物學(xué)零度和有效積溫的其他因素

科學(xué)研究表明，甲殼動(dòng)物生物學(xué)零度和有效積溫對(duì)繁殖水域時(shí)空變化存在響應(yīng)：絨螯近方蟹（Hemigrapsus penicillatus）在5—9月高溫季節(jié)繁殖旺盛，生物學(xué)零度達(dá)到12℃，其溞狀幼體發(fā)育有效積溫為226.35℃·d[5]；斑節(jié)對(duì)蝦溞狀幼體發(fā)育的生物學(xué)零度為13℃，這是由于斑節(jié)對(duì)蝦生活在水溫較高的亞熱帶水域，生長發(fā)育的環(huán)境溫度較高[21]。而在本實(shí)驗(yàn)中，中華絨螯蟹的繁殖在沿海多風(fēng)地區(qū)的春季進(jìn)行，溫度相對(duì)較低，生物學(xué)零度低至6.91℃，有效積溫也累積到274.18℃·d。

本實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)恒溫條件下進(jìn)行，設(shè)置的溫度雖不能完全反映室外育苗池塘的溫度變化，但由于其他條件的設(shè)置都和室外育苗池塘相近，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于預(yù)測苗種上市日期有一定意義，可為中華絨螯蟹人工育苗研究提供科學(xué)依據(jù)。此外，本實(shí)驗(yàn)所用蟹苗限于長江水系，因而對(duì)長江水系中華絨螯蟹生產(chǎn)更具參考價(jià)值。