苗苗，徐彩煌，黃子惠，張小東，張興*，吳永平*

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物物理系，杭州 310058；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院病理科，杭州 310058；3.浙江大學(xué)冷凍電鏡中心，杭州 310058；4.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，杭州 311300）

傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease,IBD）已遍布全球各地的養(yǎng)禽地區(qū)[1]。傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）是IBD的病原，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制[2-3]。IBDV屬于雙RNA病毒科，禽雙RNA病毒屬，其基因組由A、B雙鏈RNA（double-stranded RNA,dsRNA）節(jié)段組成，全長(zhǎng)約6.0 kbp，其中A節(jié)段（約3.2 kbp）含有2個(gè)部分折疊的開放閱讀框（open reading frame,ORF）：大ORF編碼一個(gè)110 kDa的多聚蛋白前體（pVP2-VP4-VP3），可自行加工成為2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3及一個(gè)絲氨酸蛋白酶VP4；小ORF編碼一個(gè)17 kDa的非結(jié)構(gòu)蛋白VP5。VP2是病毒的主要保護(hù)性抗原和主要結(jié)構(gòu)蛋白，與中和抗體的誘導(dǎo)和識(shí)別、病毒粒子毒力的變異、細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)、抗原漂移和細(xì)胞嗜性有很大的關(guān)系[4]。VP3是一個(gè)多功能蛋白，其作用主要包括：1）在病毒裝配過程中作為支架蛋白和招募病毒蛋白VP1進(jìn)入病毒粒子；2）與病毒基因組RNA作用；3）調(diào)節(jié)VP1的活性；4）抗細(xì)胞凋亡[5]。VP5蛋白不是病毒復(fù)制的必需蛋白，但在病毒的傳播和發(fā)病機(jī)制中有重要作用[6-7]。B節(jié)段dsRNA（約2.8 kbp）編碼一個(gè)約90 kDa的VP1蛋白——RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）[8]，RdRp與病毒dsRNA結(jié)合，負(fù)責(zé)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[9]。

dsRNA病毒的宿主范圍廣，從細(xì)菌到人類，分為7科（呼腸孤病毒科、金色病毒科、囊狀噬菌體科、雙RNA病毒科、小雙RNA病毒科、雙分病毒科和全病毒科）。dsRNA病毒基因組包含的RNA片段數(shù)目不一，從全病毒科僅包含1個(gè)RNA片段到一些輪狀病毒中包含12個(gè)RNA片段[10]。目前，關(guān)于dsRNA病毒內(nèi)部基因組的組裝方式已有報(bào)道[11-12]。LUQUE等[13]發(fā)現(xiàn)，IBDV顆?？梢园b超過1個(gè)完整的基因組，且具有更大基因組拷貝數(shù)的IBDV顆粒具有更高的感染率，表明IBDV具有與其他dsRNA病毒完全不同的基因組包裝和復(fù)制策略。但目前關(guān)于IBDV結(jié)構(gòu)的研究主要集中在其蛋白衣殼方面[14-16]，僅獲得了IBDV衣殼蛋白的晶體結(jié)構(gòu)[9]，其基因組在其衣殼內(nèi)部的包裝方式和結(jié)構(gòu)還不清楚。本文通過感染DF-1細(xì)胞獲取IBDV，利用冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)獲得了中等分辨率的IBDV三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，IBDV與其他dsRNA病毒如呼腸孤病毒科胞質(zhì)型多角體病毒（cytoplasmic polyhedrosis virus,CPV）[12]、藍(lán)舌病毒（bluetongue virus,BTV）[17]、輪狀病毒（rotavirus,RV）[18]的三維結(jié)構(gòu)明顯不同，在IBDV衣殼內(nèi)部未觀察到dsRNA基因組和RNA聚合酶的電子密度，暗示IBDV的dsRNA基因組的包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制可能不同于其他dsRNA病毒。該結(jié)果可為揭示IBDV的起源進(jìn)化和致病的分子機(jī)制提供結(jié)構(gòu)學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及儀器

IBDV由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授提供；負(fù)染觀察在FEI Tecnai G2 Spirit 120 kV透射電子顯微鏡下進(jìn)行，冷凍樣品檢查在FEI Talos F200C 200 kV冷凍電鏡下進(jìn)行，冷凍樣品用FEI Vitrobot裝置制備，數(shù)據(jù)收集使用FEI Titan Krios 300 kV低溫場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡；普通碳支持膜銅網(wǎng)購自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司；碳微陣列支持膜銅網(wǎng)購自德國Quantifoil公司；氧化石墨烯溶液購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 病毒培養(yǎng)及純化

首先將IBDV株接種至DF-1細(xì)胞上，待出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí)收獲病毒。將收獲的2 L IBDV上清液離心（5 000g，4 ℃，30 min），棄細(xì)胞碎片，然后加入500 mL 40%的聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）8000到病毒上清液中，于4℃條件下緩慢攪拌過夜，再經(jīng)過1.6×104g、4 ℃離心1 h，去除上清液，收集IBDV沉淀。將沉淀用20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）懸浮后吹打混勻，用24%的蔗糖墊在1.05×105g、4℃條件下離心2 h后棄上清液，然后加入400 μL Tris-HCl（pH 7.4），于4℃條件下過夜，接著將病毒沉淀吹打混勻后加至碘克沙醇梯度溶液（10%、20%、30%、40%、55%）中，以2.1×105g、4 ℃離心4 h，最后使用注射器小心抽取出各梯度溶液中的病毒條帶，并進(jìn)行緩沖液置換，于4℃條件下保存。

1.3 間接免疫熒光試驗(yàn)

為檢測(cè)分離純化的IBDV顆粒是否完整、是否有感染性，通過間接免疫熒光試驗(yàn)（immunofluorescent assay,IFA）進(jìn)行觀察[6]。試驗(yàn)步驟大致如下：IBDV感染DF-1細(xì)胞后48 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)基；用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution,PBS）洗2次；加入100 μL等體積丙酮和甲醇的混合液，然后在－20℃條件下放置30 min；PBS清洗3次；用5%脫脂奶在37℃條件下封閉2 h；在抗VP5單抗中于37℃條件下孵育1 h；PBS清洗3次；在用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶200）中于37 ℃條件下孵育1 h；PBS清洗3次；用10 μg/mL 4’，6-二 脒 基 -2-苯 基 吲 哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）于室溫條件下染核5 min，然后用PBS清洗3次，在倒置顯微鏡下觀察。

1.4 透射電鏡負(fù)染色觀察

吸取3 μL IBDV樣品于普通碳支持膜銅網(wǎng)上，吸附1 min后，用濾紙將表面樣品液滴吸干，隨即用2%醋酸鈾溶液染色3次（染色時(shí)間分別為10 s、10 s、1 min），然后用FEI Tecnai G2 Spirit透射電子顯微鏡觀察IBDV的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5 冷凍樣品制備及數(shù)據(jù)收集

使用FEI Vitrobot快速冷凍IBDV樣品的方法如下：將Vitrobot樣品室的濕度調(diào)至100%，吸取2.5 μL IBDV樣品，滴加于鋪有氧化石墨烯的Quantifoil（2/2）銅網(wǎng)上，使用Vitrobot濾紙吸7.5 s，除去多余的液體后快速落至液氮冷卻的液態(tài)乙烷中；之后利用Titan Krios 300 kV電子顯微鏡和Gatan K2 Summit相機(jī)收集數(shù)據(jù)，放大倍數(shù)為1.8×104倍，對(duì)應(yīng)的像素大小為1.634 ?；圖像曝光時(shí)間6～8 s，總電子劑量≈50 e－/像素。用Motion Corr2矯正圖像漂移。原始4K×4K圖像經(jīng)過2×2像素平均后產(chǎn)生2K×2K圖像，對(duì)應(yīng)的 像 素 大 小 為 3.268 ?，之 后 使 用 RELION[19]、cryoSPARC[20]等進(jìn)行圖像處理和三維重構(gòu)，其中圖像欠焦和像散用Gctf確定[21]，二維及三維分類后，最終選取5 493個(gè)病毒顆粒進(jìn)行取向優(yōu)化和三維重構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 純化的IBDV對(duì)DF-1細(xì)胞的感染

為檢測(cè)純化的IBDV是否為完整的病毒顆粒并具有感染性，應(yīng)用間接IFA方法檢測(cè)經(jīng)純化的IBDV感染的DF-1細(xì)胞與抗IBDV VP5單抗的反應(yīng)性。如圖1所示，在感染純化的IBDV的DF-1細(xì)胞上瞬間表達(dá)的VP5蛋白與抗VP5單抗發(fā)生了特異性反應(yīng)。該結(jié)果表明，純化的IBDV能夠感染DF-1細(xì)胞并復(fù)制和繁殖。

圖1 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)純化的IBDV病毒的感染性Fig.1 Infectivity assay of purified IBDV on DF-1 cells detected with indirect immunofluorescent assay

2.2 IBDV冷凍電鏡結(jié)果

將IBDV樣品經(jīng)冷凍制樣后，利用FEI Titan Krios 300 kV低溫場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡收集數(shù)據(jù)。從IBDV的冷凍圖像（圖2A）中，可以清晰地觀察到病毒的外部形態(tài)，樣品有2種不同狀態(tài)的病毒顆粒：大多數(shù)病毒顆粒為包裝dsRNA基因組的完整病毒顆粒，少數(shù)為不含dsRNA的空病毒顆粒（圖2A箭頭所示）。利用cryoSPARC和RELION軟件對(duì)采集的IBDV冷凍電鏡數(shù)據(jù)處理分析后獲得了≈6.6 ?分辨率的IBDV三維結(jié)構(gòu)（圖2B～C）。三維結(jié)構(gòu)顯示，病毒顆粒直徑≈70 nm，病毒衣殼由VP2三聚體構(gòu)成，同時(shí)，VP2形成了五聚體及六聚體2種多聚體形式。IBDV衣殼形成三角形剖分函數(shù)T=13的二十面體結(jié)構(gòu)，與以前報(bào)道的IBDV結(jié)構(gòu)[14]一致，也與B?TTCHER等[16]用冷凍電鏡做過的分辨率≈20 ?的IBDV的衣殼結(jié)構(gòu)一致。IBDV衣殼由260個(gè)VP2三聚體組成，其中20個(gè)VP2三聚體位于3次軸上，稱為“I3三聚體”，4個(gè)VP2三聚體組成一個(gè)大的三角形，稱為“G4三角形”?！癎4三角形”與“I3三聚體”組成了一個(gè)非對(duì)稱單元，其中“I3三聚體”連接3個(gè)“G4三角形”組成二十面體的一個(gè)平面。將獲得的電鏡結(jié)構(gòu)與IBDV晶體結(jié)構(gòu)[14]比較，發(fā)現(xiàn)兩者的大部分蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)吻合很好（圖2D～F）。

圖2IBDV三維重構(gòu)Fig.2 Three-dimensional reconstruction of IBDV by cryo-EM

2.3 IBDV與其他dsRNA病毒結(jié)構(gòu)的比較

dsRNA病毒的三維結(jié)構(gòu)已被廣泛研究，包括衣殼和內(nèi)部基因組結(jié)構(gòu)。我們通過三維重構(gòu)獲得了生理狀態(tài)下IBDV的三維結(jié)構(gòu)，與其他已知dsRNA病毒結(jié)構(gòu)如呼腸孤病毒科的胞質(zhì)型多角體病毒（CPV）[12]、藍(lán)舌病毒（BTV）[17]和輪狀病毒（RV）[18]相比，在IBDV內(nèi)部未觀察到典型的≈20 ?的dsRNA特征密度，同時(shí)，在衣殼內(nèi)表面的5次軸附近也沒有觀察到病毒RNA聚合酶的電子密度（圖3A）。而作為對(duì)比，在其他3種dsRNA病毒結(jié)構(gòu)內(nèi)部都可以觀察到明顯的dsRNA及其聚合酶電子密度（圖3B～D）。此外，IBDV的基因組密度也明顯不同于其他dsRNA病毒。從表1可以看出：IBDV的衣殼內(nèi)直徑最大，約為54 nm，其他3種病毒為47～52 nm；IBDV基因組總長(zhǎng)約為6.0 kbp，其他3種病毒分別為24.7、19.0和18.0 kbp；IBDV基因組密度約為0.072 bp/nm3，其他均約為0.3 bp/nm3，說明IBDV衣殼內(nèi)基因組密度明顯低于其他3個(gè)dsRNA病毒。這些差別暗示IBDV病毒在基因組包裝、轉(zhuǎn)錄復(fù)制方面與其他dsRNA病毒不同。

圖3IBDV與其他dsRNA病毒內(nèi)部結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig.3 Difference between IBDV and three other dsRNAviruses at their central sections

表1IBDV與其他dsRNA病毒的比較Table 1 Comparison between IBDV and three other dsRNAviruses

3 討論

為了避免病毒dsRNA在細(xì)胞質(zhì)中引起宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)，dsRNA病毒必須把其dsRNA基因組片段保護(hù)在其衣殼內(nèi)部，同時(shí)，每個(gè)dsRNA片段均包裝一個(gè)核酸轉(zhuǎn)錄酶，并且這個(gè)核酸轉(zhuǎn)錄酶固定結(jié)合在衣殼內(nèi)表面的5次軸附近。在感染宿主細(xì)胞期間，每條dsRNA片段均在病毒衣殼內(nèi)部高效地獨(dú)立進(jìn)行轉(zhuǎn)錄復(fù)制，互不干擾。如在CPV、BTV和RV病毒衣殼內(nèi)部分別包裝了10、10和11條dsRNA片段和對(duì)應(yīng)的核酸轉(zhuǎn)錄酶。但dsRNA病毒基因組片段是如何包裝在衣殼內(nèi)部以保證不同的病毒dsRNA基因組片段的有序轉(zhuǎn)錄的，一直是未解之謎。

IBDV病毒基因組比較簡(jiǎn)單，只有2條不同的dsRNA片段，因此很適合用于解析dsRNA病毒基因組是如何包裝的秘密。盡管目前對(duì)于IBDV結(jié)構(gòu)的研究已有很多，例如B?TTCHER等[16]也用冷凍電鏡做過IBDV的結(jié)構(gòu)研究，但分辨率僅約為20 ?，同時(shí)該研究也沒有報(bào)道衣殼內(nèi)部基因組的結(jié)構(gòu)信息，因此，關(guān)于IBDV衣殼內(nèi)部dsRNA的結(jié)構(gòu)信息知之甚少。本研究利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)，獲得了在生理狀態(tài)下IBDV約6.6 ?分辨率的三維結(jié)構(gòu)。但與其他已知結(jié)構(gòu)的dsRNA病毒相比，在IBDV內(nèi)部并未觀察到特征性的dsRNA電子密度和RNA聚合酶電子密度。該結(jié)果可能存在2種原因：一是IBDV衣殼破裂，導(dǎo)致病毒dsRNA和RNA聚合酶從衣殼內(nèi)部釋放出來；二是IBDV基因組dsRNA可能存在與其他dsRNA病毒基因組完全不同的組裝方式。由于在數(shù)據(jù)處理過程中，我們選擇的是完整的、內(nèi)部含有dsRNA基因組的病毒顆粒進(jìn)行三維重構(gòu)，同時(shí)，我們用純化的IBDV病毒對(duì)DF-1細(xì)胞進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，純化的IBDV能夠感染DF-1細(xì)胞并復(fù)制繁殖，說明純化的IBDV病毒基因組具有完整性。因此，在IBDV衣殼內(nèi)部觀測(cè)不到dsRNA的最可能原因?yàn)楹笳?，即IBDV的dsRNA基因組采取了與其他dsRNA病毒基因組完全不同的包裝方式。根據(jù)LUQUE等[13]的發(fā)現(xiàn)，在IBDV內(nèi)部可包裝多于1個(gè)基因組拷貝，且基因組拷貝數(shù)與病毒的毒力相關(guān)。通過與3個(gè)dsRNA病毒衣殼內(nèi)部體積、包裝基因組數(shù)目及基因組包裝密度對(duì)比，發(fā)現(xiàn)IBDV衣殼內(nèi)基因組密度明顯低于其他3個(gè)dsRNA病毒，衣殼內(nèi)部可包裝多個(gè)基因組?？傊?，本結(jié)果表明，IBDV基因組采用了與其他dsRNA病毒基因組不同的組裝方式，暗示IBDV的起源和進(jìn)化與其他已知基因結(jié)構(gòu)的dsRNA病毒不同。該結(jié)果也說明，使用單顆粒冷凍電鏡方法不能解析出IBDV病毒內(nèi)部的三維結(jié)構(gòu)，需要使用冷凍電子斷層三維重構(gòu)的方法來進(jìn)行IBDV基因組的結(jié)構(gòu)研究。

致謝 文中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集自浙江大學(xué)冷凍電鏡中心，謹(jǐn)致謝意！