徐 楊， 彭 慧， 蘇雪蓮

(濟南市第五人民醫(yī)院婦產科， 山東 濟南 250022)

卵巢癌是嚴重威脅女性健康和生命的三大生殖系統(tǒng)型惡性腫瘤之一。資料顯示近年來卵巢癌的發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢，患者的致死率高達85%[1]。缺乏特異性早期診斷指標和治療抗性是卵巢癌高致死率的主要原因[2]。目前，卵巢癌的治療方案主要以早期手術切除為主輔以放化療，但轉移性卵巢癌對手術和藥物治療的預后較差[3]。因此，尋找和開發(fā)卵巢癌靶向治療藥物迫在眉睫。

組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶EZH2(enhancer of zeste homolog 2)是PRC2復合物的核心組分，具有甲基轉移酶活性，催化組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)，在多種靶基因啟動子上的修飾介導基因表達沉默[4]。研究發(fā)現(xiàn)EZH2在前列腺癌、乳腺癌和淋巴瘤中高表達[5-8]，提示EZH2是一個促腫瘤因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。細胞衰老(cellular senescence)是一種細胞周期的不可逆阻滯，是拮抗腫瘤細胞增殖的程序之一，因此通過誘導細胞衰老來抑制或治療腫瘤的研究受到重視[9-10]。通過促衰老機制來治療腫瘤比其它細胞毒性藥物對人體的損傷更少，副作用更低[11]。因此，研發(fā)誘導細胞衰老的抗腫瘤藥在干預腫瘤方面有著廣闊的前景。近新研究發(fā)現(xiàn)，EZH2介導的H3K27me3與細胞衰老相關[12]；而卵巢癌細胞的放療耐受與DNA損傷修復和細胞衰老程序的異常密切相關[13]；研究表明EZH2異常表達能抑制卵巢癌細胞衰老，提示EZH2是開發(fā)促卵巢癌細胞衰老療藥物的潛在靶點[14]。目前，EZH2促進卵巢癌細胞衰老的遺傳學或表觀遺傳學機制仍不完全清楚。本研究觀察EZH2異常表達對卵巢癌細胞衰老的影響，并探討其作用機制，為以EZH2為靶點開發(fā)治療卵巢癌的新型表觀遺傳藥物提供科學依據。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

1.1標本收集 收集濟南市第五人民醫(yī)院婦產科2012年1月～2018年6月確診為卵巢腫瘤患者的癌組織35例和良性卵巢囊腫組織41例。所有患者均沒有接受放化療，標本置于液氮中保存。所有患者術前簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會的批準。

1.2細胞株與試劑 人卵巢癌細胞系Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434以及人正常卵巢上皮細胞IOSE80購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和雙抗購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT、DMSO和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自Sigma；GSK126購自ECM；抗EZH2、p53、p21和p16抗體購自Cell Signal Technology；抗Ki67、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、cleaved PARP和H3K27me3抗體購自Abcam；抗β-actin抗體購自Santa Cruz；總RNA 提取試劑、逆轉錄試劑盒(PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser)和實時熒光定量PCR(real-time PCR)試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ)購自 TaKaRa；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中；IOSE80細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基均含10% FBS、1%青霉素和1%鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2及完全濕度的培養(yǎng)箱中。當細胞密度為60%～70% 時進行細胞傳代。

2.2Real-time PCR 按照TRIzol試劑說明書提取卵巢癌細胞系、癌組織和正常組織的總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，反應條件為42 ℃ 2 min、37 ℃ 20 min、85 ℃ 1 min，合成cDNA。取2 ng cDNA進行real-time PCR反應，引物序列見表1。反應條件為95 ℃預變性5 min; 95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用SYBR Green Ⅱ熒光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)進行real-time PCR數(shù)據分析，結果經β-actin校正，基因相對表達量用 2-ΔΔCt表示。

表1 Real-time PCR引物序列

2.3siRNA合成及細胞轉染 針對EZH2基因開放閱讀框序列，運用Ambion的網上在線軟件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)設計EZH2小干擾RNA(EZH2small interfering RNA, siEZH2)，同時設計陰性對照siRNA(negative control siRNA, siRNA-NC)，由Sigma合成。Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434細胞以每孔4×104個接種到6孔板中，細胞密度達到65%左右時進行轉染(脂質體2000法)。先用無血清OptiMEM培養(yǎng)液將脂質體2000稀釋和配制10 mmol/L siRNA，然后將等體積脂質體2000和siRNA輕輕混勻，室溫靜置10 min后加入細胞中，培養(yǎng)4 h后換成完全培養(yǎng)基；以轉染siRNA-NC為陰性對照。

2.4MTT法測定細胞活力 細胞轉染48 h時，以細胞密度為每孔2.5×104個接種96孔板，培養(yǎng)72 h時進行MTT檢測；COV434細胞以每孔2.5×104個接種96孔板中培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基，加入終濃度為20 μmol/L的GSK126，以DMSO處理為對照組，作用72 h時進行MTT實驗；加入20 μL 5 g/L的MTT，培養(yǎng)4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，輕微振蕩使結晶完全溶解，酶標儀測定570 nm處的吸光值(A)值。

2.5集落形成實驗 細胞轉染48 h時，細胞經消化計數(shù)后以每孔1 000個接種于6孔板中培養(yǎng)，直到通過肉眼能清晰觀察到可見的細胞集落(>50個細胞)；COV434細胞以每孔1 000個接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基，加入終濃度為20 μmol/L GSK126，以DMSO處理為對照組，每隔3 d補充1次GSK126(終濃度均為20 μmol/L)；棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌，甲醇固定，PBS洗滌，吉姆薩染色，自來水清洗，晾干后計數(shù)，按下列公式計算：集落形成率(%)=細胞集落數(shù)平均值/鋪板細胞數(shù)×100%。

2.6流式細胞術 COV43細胞經終濃度為20 μmol/L GSK126或DMSO作用72 h時收集細胞；細胞轉染72 h時用PBS洗滌，胰酶消化、離心收集細胞，按照Annexin-V/PI試劑盒說明書操作，先加入500 μL的binding buffer重懸細胞，再加入5 μL FITC標記的Annexin-V和5 μL PI混勻，室溫下避光孵育15 min，運用流式細胞儀測定細胞凋亡。

2.7電離輻射照射和SA-β-Gal染色 IOSE80細胞以每孔3 000個接種于6孔板，培養(yǎng)24 h時進行siRNA轉染，培養(yǎng)48 h時經5 Gy電離輻射照射；將6孔板用封口膜封好，轉移至X射線輻照儀中照射，劑量率為0.36 Gy/min；電離輻射照射后72 h時按照試劑盒說明書操作進行β-Gal染色；顯微鏡下觀察并拍照，隨機選擇20個視野計數(shù)，取平均值，計算SA-β-Gal染色陽性細胞率。

2.8Western blot實驗 siRNA轉染的Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434細胞48 h時收集細胞。siRNA轉染的IOSE80細胞培養(yǎng)48 h時細胞經5 Gy電離輻射照射培養(yǎng)72 h時收集細胞。COV434細胞經終濃度為20 μmol/L GSK126或DMSO作用72 h時進行5 Gy電離輻射，電離輻射后再補充1次GSK126，培養(yǎng)48 h后收集細胞。加入RIPA細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5% 脫氧膽酸鈉，0.1% SDS)，超聲破碎、12 000×g，4 ℃離心15 min，BCA法測定蛋白濃度；以20 μg蛋白進行SDS-PAGE，將蛋白轉移到硝酸纖維膜上，10%脫脂奶粉封閉，孵育 I 抗(EZH2、p53、p21、p16、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase 9、 cleaved caspase 9、H3K27me3、H3K27me2、H3K27me1和β-actin)，4 ℃過夜。洗膜、孵育HRP-IgG II 抗，室溫1 h。ECL顯影后掃描，再用Quanity-One軟件分析。

2.9免疫組織化學染色和觀察 收集的卵巢癌組織及癌旁組織經4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋和切片。將組織切片固定，脫蠟，乙醇脫水，3% H2O2處理除去內源性過氧化氫酶，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液進行抗原修復，孵育 I 抗(EZH2和Ki67)，洗片，孵育 II 抗，洗片，DAB顯色，封片待觀察。顯微鏡下觀察拍照，采用Image-Pro Express 6.0數(shù)碼成像系統(tǒng)軟件拍照分析。

3 統(tǒng)計學處理

實驗進行3次獨立重復實驗。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行相關數(shù)據分析，結果用均值±標準差(mean±SD)表示，兩組之間的比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 EZH2在卵巢癌組織和細胞中的表達水平

Real-time PCR結果顯示EZH2在卵巢癌組織中的mRNA表達水平顯著高于正常組織(P<0.01)，見圖1A；免疫組織化學染色結果進一步證實EZH2蛋白在卵巢癌組織中呈強陽性染色，而在癌旁組織呈EZH2陰性或弱陽性染色，見圖1B；同樣，4種卵巢癌細胞中的EZH2的mRNA和蛋白水平顯著高于IOSE80細胞(P<0.05)，見圖1C、D；EZH2的催化產物H3K27me3的水平也明顯增高(P<0.05)，見圖1D。這些結果提示EZH2的表達水平與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展相關。

Figure 1.The expression levels of EZH2 in the ovarian cancer tissues and cells. A: real-time PCR was used to detect EZH2 mRNA expression in the ovarian cancer tissues and normal tissues; B: immunohistochemical staining was used to detect EZH2 protein expression in ovarian cancer (n=35) and normal (n=41) tissues; C: the mRNA expression of EZH2 in the ovarian cancer cells and IOSE80 cells was detected by RT-qPCR; D: the results of Western blot for detecting EZH2 protein expression and H3K27me3 level in the ovarian cancer cells and IOSE80 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsnormal tissues;**P<0.01vsIOSE80 cells.

圖1 EZH2在卵巢癌組織和細胞中的表達水平的比較

2 EZH2低表達對卵巢癌細胞增殖的影響

與siRNA-NC組細胞比較，siEZH2介導Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434細胞中的EZH2低表達，同時H3K27me3的水平也明顯降低，但H3K27me2和H3K27me1水平無明顯變化，見圖2A；EZH2在4種卵巢癌細胞中的表達水平均顯著降低(P<0.01)，見圖2B；MTT實驗結果顯示，與對照組比較，干擾EZH2表達顯著抑制4種卵巢癌細胞的活力(P<0.01)，見圖2C；免疫組織化學染色結果表明Ki67(細胞增殖的標志物)在卵巢癌組織中的表達水平顯著高于正常組織，見圖2D。集落形成實驗結果顯示，干擾EZH2的表達減少4種卵巢癌細胞的集落形成(P<0.01)，見圖3A、B；EZH2的甲基轉移酶抑制劑GSK126也能抑制卵巢癌細胞的集落形成(P<0.01)，見圖3A、C，其作用與干擾EZH2的表達類似。以上結果表明EZH2是一個腫瘤促進因子，其高表達能促進卵巢癌細胞增殖，且EZH2促進細胞增殖是通過H3K27me3發(fā)揮作用的。

3 EZH2低表達對卵巢癌細胞凋亡的影響

流式細胞術結果顯示，EZH2低表達或GSK126作用對4種卵巢癌細胞凋亡無影響，與對照組比較差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，見圖3D、E。

4 EZH2低表達對正常卵巢上皮細胞衰老的影響

干擾EZH2的表達明顯升高電離輻射誘導的IOSE80細胞 SA-β-Gal陽性率，具有時間依賴關系，見圖4A。統(tǒng)計分析結果顯示，EZH2低表達的細胞SA-β-Gal陽性率顯著高于siRNA-NC組細胞(P<0.01)，見圖4B。Real-time PCR結果顯示，與對照組比較，干擾EZH2的表達顯著促進p16和p21的mRNA表達，具有時間依賴關系(P<0.01)，見圖4C、D。上述結果表明抑制EZH2介導的H3K27me3水平可促進細胞衰老，進而抑制卵巢癌細胞增殖。

5 EZH2低表達對細胞增殖信號通路的影響

Western blot結果顯示，在IOSE80細胞中干擾EZH2表達明顯激活p53及其下游靶基因p21的表達，同時細胞衰老通路重要標志物p16的表達水平也被明顯激活；電離輻射照射激活p53、p21及p16的蛋白表達，而干擾EZH2能明顯抑制電離輻射誘導的p53、p21及p16表達(P<0.01)，見圖5A、C。相同條件下，下調EZH2對caspase-3和PARP的蛋白水平無影響，提示抑制EZH2表達不能激活細胞凋亡通路，見圖5A、E，與流式細胞術分析的結果相一致。我們用H3K27me3抑制劑GSK126作用COV434細胞后，同樣發(fā)現(xiàn)GSK126呈劑量依賴性抑制EZH2和H3K27me3的水平，但對H3K27me2和H3K27me1的水平無影響，見圖5B、D、F。同時，GSK126能激活p53和p16蛋白表達，具有劑量依賴關系，但對caspase 通路無影響，見圖5B、D、F。上述結果表明抑制EZH2表達通過降低H3K27me3水平，激活p53和p16通路而誘導細胞衰老。

Figure 2.The effect ofEZH2 expression knock-down on the viability and the expression of proliferation marker Ki67 in the ovarian cancer cells. A: siEZH2 transfection mediated the low expression of EZH2 in ovarian cancer cells; B: the quantitative analysis of EZH2 protein expression in ovarian cancer cells; C: MTT assay was used to detect the viability of ovarian cancer cells; D: the quantitative analysis of Ki67 protein expression in ovarian cancer (n=35) and normal tissues (n=41). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-NC group.

圖2 敲減EZH2表達對卵巢癌細胞活力和增殖分子表達的影響

Figure 3.The effect ofEZH2expression knock-down on colony formation and apoptosis of ovarian cancer cells. A: colony formation test to detect the colony formation ability of ovarian cancer cells; B and C: quantitative analysis of ovarian cancer cell colony formation rate; D and E: quantitative analysis of ovarian cancer cell apoptosis rate. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-NC group.

圖3 下調EZH2表達對卵巢癌細胞集落形成能力和細胞凋亡的影響

Figure 4.The effect ofEZH2expression knock-down on the senescence of IOSE80 cells after 10 Gy of ionizing radiation (IR). A: SA-β-Gal staining was used to detect cellular senescence (×10); B: quantitative analysis of SA-β-Gal positive rate of IOSE80 cells; C and D: real-time PCR was used to detected p21 and p16 mRNA expression in IOSE80 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-NC group.

圖4 EZH2低表達對電離輻射后正常卵巢上皮細胞衰老的影響

討 論

多梳蛋白(Polycomb-group proteins, PcG)復合物由多梳蛋白抑制復合物1(Polycomb repressive complex 1, PRC1)和PRC2組成[15]，EZH2是PRC2的核心組成成分，是PcG家族成員中唯一具有甲基轉移酶功能的表觀遺傳沉默子，EZH2與靶基因啟動子區(qū)域結合介導H3K27me3的修飾，沉默靶基因的表達[16-17]。研究表明EZH2介導的H3K27me3水平在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[5-8]。EZH2和H3K27me3在原發(fā)性肝細胞癌中高表達，與其不良預后呈正相關，可作為肝細胞癌早期診斷的生物標志物[18-19]。然而EZH2在卵巢癌中的生物學功能尚不完全清楚。本研究運用real-time PCR、免疫組化及Western blot從mRNA和蛋白水平對卵巢癌組織樣本進行EZH2表達水平的檢測，發(fā)現(xiàn)EZH2在卵巢癌組織中高表達，提示EZH2表達水平與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關。同時本研究在細胞水平進一步證實EZH2和H3K27me3在4種卵巢癌細胞中高表達，與文獻報道EZH2及H3K27me3在其它腫瘤組織中高表達相符[5-8]。

本研究進一步探討了EZH2和H3K27me3高表達對卵巢癌細胞惡性表型的影響，結果發(fā)現(xiàn)干擾EZH2表達明顯降低H3K27me3的水平，而對H3K27me2和H3K27me1水平無影響，說明H3K27me3是EZH2的特異性催化底物。同時干擾EZH2顯著抑制4種卵巢癌細胞增殖和集落形成，EZH2甲基轉移酶活性抑制劑GSK126對細胞增殖的抑制作用與干擾EZH2的表達類似，說明下調EZH2表達抑制卵巢癌細胞增殖是通過降低H3K27me3水平而實現(xiàn)，相同條件下干擾EZH2對細胞凋亡無明顯影響。研究表明EZH2非特異性抑制劑DZNep通過激活DNA損傷應答通路誘導肝細胞癌細胞凋亡[20]，與本研究結果不符。這可能與腫瘤類型以及藥物靶向性不高有關，因為DZNep具有非依賴于EZH2的生物學功能[21]。同時我們在卵巢癌組織水平也發(fā)現(xiàn)Ki67(細胞增殖的標志物)在卵巢癌組織中高表達，證實EZH2介導的H3K27me3水平能促進卵巢癌細胞的惡性表型。

Figure 5.The effect ofEZH2expression knock-down on the protein levels of cell proliferation- and apoptotic signaling pathway-related molecules in the ovarian cancer cells. A: Western blot images of the proteins in IOSE80 cells 3 and 6 d after 5 Gy of ionizing radiation (IR); B: Western blot images of the proteins in COV434 cells treated with GSK126 3 d after 5 Gy of IR; C and E: the quantitative analysis of A; D and F: the quantitative analysis of B. Mean±SD.n=3.*P<0.01vssiRNA-NC group;#P<0.05vs0 μmol/L group.

圖5 下調EZH2表達對卵巢癌細胞增殖和凋亡信號通路相關分子蛋白水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)EZH2通過表觀遺傳機制沉默多種腫瘤抑制因子的表達促進腫瘤的發(fā)生，如miR-139-5p、miR-125b、miR-101、let-7c和miR-200b[22]；干擾EZH2表達通過抑制細胞自噬逆轉卵巢癌細胞對順鉑的耐受[23]。SA-β-Gal染色結果發(fā)現(xiàn)干擾EZH2表達明顯促進電離輻射誘導的細胞衰老，同時細胞周期阻滯因子p21和細胞衰老標志物p16的轉錄水平顯著增加，說明EZH2通過調控細胞衰老通路而不是細胞凋亡通路促進細胞惡性表型。我們用Western blot實驗證這一假設，結果發(fā)現(xiàn)下調EZH2表達能激活p53及下游信號通路以及細胞衰老p16通路，對細胞凋亡通路如caspase 3和PARP通路無影響。本研究發(fā)現(xiàn)EZH2在卵巢癌組織中高表達，EZH2通過調控細胞衰老通路促進卵巢癌細胞惡性表型。因此EZH2可作為一種新的卵巢癌診斷標志物及研發(fā)表觀遺傳藥物的靶點。