羅永光

（淮安生物工程高等職業(yè)學(xué)校，江蘇淮安 223200）

蘆?。≧utin）又稱(chēng)蕓香苷，是維生素P 的主要成分。蘆丁是一種從植物中提取的黃酮類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)是由槲皮素 C3 位上的羥基和蕓香糖結(jié)合而形成的雙糖苷[1]。蘆丁具有抗炎、抑菌、抗病毒和抗氧化等作用，目前廣泛應(yīng)用于防治腦溢血、高血壓、關(guān)節(jié)炎等疾病。在飼料中添加黃酮類(lèi)化合物可促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、提高生產(chǎn)性能和改善繁殖性能等[2]。有研究表明，在日糧中添加適量的蘆丁能夠提高奶牛泌乳性能，保持乳品質(zhì)，降低奶牛血清中尿素氮的水平和抑制甲烷的生成，提高血清溶菌酶的含量以及通過(guò)提高瘤胃內(nèi)容物固相和液相濾紙酶、β-葡萄糖苷酶、羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶的活性來(lái)提高奶牛的消化和代謝[3-6]。另外，蘆丁能夠提高大鼠泌乳量，促進(jìn)免疫器官胸腺和脾臟的發(fā)育[7-8]。以上表明，作為黃酮類(lèi)物質(zhì)的蘆丁可以作為一種綠色添加劑在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用。目前，關(guān)于蘆丁對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞影響的研究未見(jiàn)報(bào)道，蘆丁提高奶牛泌乳性能的機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以體外細(xì)胞培養(yǎng)法來(lái)研究蘆丁對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的影響，為豐富相關(guān)理論提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 蘆丁（含量≥98 %）由上海源葉生物科技有限公司提供，奶牛乳腺上皮細(xì)胞通過(guò)組織塊培養(yǎng)法獲得，胎牛血清和DMEM/F12 購(gòu)于美國(guó)的Gibco 公司，青霉素、鏈霉素和谷氨酰胺購(gòu)于美國(guó)的Sigma 公司，二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于北京的索萊寶公司，RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于天根生化有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將采集到的奶牛乳腺用含有雙抗的PBS 進(jìn)行清洗，然后根據(jù)李吉霞[9]的方法進(jìn)行組織塊培養(yǎng)法獲得乳腺上皮細(xì)胞。將純化的細(xì)胞接種在含有10% 胎牛血清、青霉素和鏈霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺等的DMEM/F12 培養(yǎng)基中， 37℃，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞活性 采用噻唑藍(lán)（MTT）法進(jìn)行細(xì)胞活性的檢測(cè)，將細(xì)胞密度調(diào)整到1×105個(gè)/mL 后接種到96 孔板中，分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加0、25、50、100、150 μg/mL蘆?。ㄈ苡诙谆鶃嗧?，二甲基亞砜含量為1‰），每組5 個(gè)重復(fù)。細(xì)胞于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h和96 h 后，分別在每孔中加入20 μL 0.5% MTT，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后去除培養(yǎng)液，用PBS 沖洗2 遍，每孔加入DMSO 150 μL 于搖床混勻10 min，最后在490 nm 下測(cè)定OD 值。

1.2.3 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 將細(xì)胞密度調(diào)整到1.5×105個(gè)/mL接種到12 孔板，分組同1.2.2，每組4 個(gè)重復(fù)。細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 和96 h 后，然后參照南京建成試劑盒上的方法檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量。

1.3 細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的測(cè)定

1.3.1 RNA 的提取 將細(xì)胞密度調(diào)整到5×105個(gè)/mL 接種到12 孔板，分組同1.2.1，每組4 個(gè)重復(fù)。細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h 后，棄除培養(yǎng)基，在6 孔板中加入1 mL 的RZ 裂解液裂。RNA 的提取方法參照試劑盒中的說(shuō)明書(shū)，提取的RNA 經(jīng)過(guò)濃度和純度的檢測(cè)后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作方法參照試劑盒中的說(shuō)明書(shū)。將cDNA 保存在-20℃冰箱待測(cè)。

1.3.2 RT-PCR 條 件 反 應(yīng) 體 系 為 20 μL：Master Mix (2×) 10 μL，上、下游引物 (10×)各1 μL，cDNA 5 μL，無(wú)酶水3 μL。反應(yīng)條件為95℃ 預(yù)變性10 min；PCR 反應(yīng)為95℃、10 s，退火60℃和72℃延伸各10 s，循環(huán)45 次；融解曲線分析65℃、60 s。

1.3.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 中的基因序列設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成，β-actin 為管家基因。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)先用Excle 2010 預(yù)處理，然后采用IBM SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），LSD 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示， P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁對(duì)乳腺上皮細(xì)胞活性的影響 由表2 可知，48 h時(shí)，100 μg/mL 和150 μg/mL 蘆丁組的細(xì)胞活性顯著高于0 μg/mL 和25 μg/mL 蘆丁組，而在96 h 時(shí)，50～150 μg/mL蘆丁組的細(xì)胞活性顯著高于0 μg/mL 蘆丁組。結(jié)果說(shuō)明，蘆丁能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，其中添加100 μg/mL 蘆丁的效果最好。

2.2 蘆丁對(duì)乳腺上皮細(xì)胞抗氧化性指標(biāo)的影響 由表3 可知，48 h 時(shí)，100 μg/mL 蘆丁組細(xì)胞的GSH-Px 和CAT活性顯著高于0 μg/mL 和25 μg/mL 蘆丁組，0 μg/mL 蘆丁組的MDA 含量和LDH 活性均顯著高于其他各組，而各組的SOD 活性沒(méi)有顯著差異；在96 h 時(shí)，0 μg/mL 蘆丁組的GSH-Px 活性和SOD 活性顯著低于100 μg/mL和150 μg/mL 蘆丁組，而MDA 含量和LDH 活性均顯著高于100 μg/mL 蘆丁組，50 μg/mL 蘆丁組的CAT 活性顯著高于其他組，150 μg/mL 蘆丁組CAT 活性最低。結(jié)果表明，蘆丁能夠提高抗氧化酶活性，進(jìn)而提高細(xì)胞的抗氧化能力，其中添加100 μg/mL 蘆丁的效果最好。2.3 蘆丁對(duì)乳腺上皮細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響 由表4可知，100 μg/mL 蘆丁組乳腺上皮細(xì)胞的Bcl-2 表達(dá)顯著高于其他組，其他各組之間差異不顯著；0 μg/mL 蘆丁組細(xì)胞的Caspase3 表達(dá)顯著高于其他組，100 μg/mL和150 μg/mL 蘆丁組細(xì)胞的P53 表達(dá)顯著低于其他組。結(jié)果表明，蘆丁能夠通過(guò)影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞的凋亡，其中添加100 μg/mL 蘆丁的效果最好。

3 討 論

劉春龍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，添加10、100 ng/mL 染料木素和添加100、1 000 ng/ mL 大豆黃酮均能夠顯著促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。穆瑩等[11]研究發(fā)現(xiàn)，添加10～1 000 mg/L 大豆異黃酮能顯著增強(qiáng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖能力與活力。另外，苜蓿黃酮也能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖[12]。以上結(jié)果表明，黃酮類(lèi)化合物能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)48 h 和96 h 時(shí)，添加100～150 μg/mL 蘆丁均能夠顯著提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性?？梢?jiàn)添加適量的蘆丁能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖。蘆丁的結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素17-β-雌二醇相似，能夠與雌激素受體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合，發(fā)揮弱雌激素效應(yīng)，進(jìn)而升高生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子和催乳素水平，促進(jìn)乳腺發(fā)育并提高產(chǎn)奶量[13]。因此，蘆丁促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖可能與它發(fā)揮弱雌激素作用有關(guān)。

表1 引物設(shè)計(jì)

表2 蘆丁對(duì)乳腺上皮細(xì)胞活性（OD 值）的影響

表3 蘆丁對(duì)乳腺上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響

表4 蘆丁對(duì)乳腺上皮細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

盧志勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，添加大豆異黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞SOD、GSH-Px 和 CAT 活性，降低MDA、NO 含量。王振云等[15]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可能通過(guò)降低 MDA 含量，增強(qiáng) SOD 活性來(lái)保護(hù)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。蘇效雙等[12]研究發(fā)現(xiàn)，添加苜蓿黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞GSH-Px 和 CAT 活性，降低LDH 活性和MDA 含量。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，添加100 μg/mL 蘆丁能提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的GSHPx 、SOD 和CAT 活性，降低LDH 活性和MDA 含量。結(jié)果說(shuō)明，添加適量的蘆丁能夠提高細(xì)胞的抗氧化性能。蘆丁作為一種黃酮類(lèi)化合物，可能從以下幾方面來(lái)發(fā)揮抗氧化作用：①在氧化過(guò)程中，釋放H+直接能夠與自由基相結(jié)合，進(jìn)而清除自由基；②與金屬離子螯合，降低金屬離子誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧自由基；③抑制脂肪氧合酶、NADH 氧化酶等氧化酶的活性，降低超氧化陰離子的產(chǎn)生[16]。

Caspase 3 被認(rèn)為是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，當(dāng)其被激活時(shí)必然會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡，因此發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)，會(huì)先活化Caspases 蛋白酶，進(jìn)而介導(dǎo)蛋白裂解。Bcl-2 基因是一種具有抑制凋亡的癌基因，能夠阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制了細(xì)胞凋亡。P53 作為抑癌基因之一，是細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，在正常狀態(tài)下其表達(dá)較低。P53 通過(guò)激活細(xì)胞凋亡受體Fas、Bax、Noxa、Puma、Apaf-1 以及線粒體膜上的Bcl-2、Bcl-xl 和Mcl-1 等凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。張錦等[17]研究蘆丁對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠通過(guò)上調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用，抑制細(xì)胞凋亡。王麗偉等[18]發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠通過(guò)上調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax 蛋白的表達(dá)和抑制Caspase 3 蛋白的活化來(lái)發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)。研究發(fā)現(xiàn)，葛根異黃酮能夠下調(diào)甲基-苯基-吡啶離子誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型P53 mRNA 的表達(dá)；在1-甲基-4-苯基-吡啶離子的誘導(dǎo)下，葛根素能夠通過(guò)下調(diào)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的P53 mRNA 的表達(dá)來(lái)保護(hù)細(xì)胞[19-20]。以上結(jié)果說(shuō)明，黃酮類(lèi)化合物能夠通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Caspase 3 和P53 的表達(dá)來(lái)保護(hù)細(xì)胞。本研究也發(fā)現(xiàn)，添加100 μg/mL 蘆丁能夠上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)和下調(diào)P53 和Caspase 3 的表達(dá)。另外，添加100 μg/mL蘆丁組的細(xì)胞活性最高。結(jié)果說(shuō)明，添加適量的蘆丁能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

有些黃酮類(lèi)化合物不僅能夠保護(hù)DNA 免受氧化損傷，但也能誘導(dǎo)DNA 損傷。黃酮是否促氧化性還是抗氧化性，主要取決于黃酮的濃度。另外，金屬離子是黃酮表現(xiàn)抗氧化性還是促氧化性的一個(gè)重要因素[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加量大于100 μg/mL 蘆丁組細(xì)胞活性、細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性均有所下降，促細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)有所增加。說(shuō)明添加高劑量蘆丁對(duì)細(xì)胞的增殖有負(fù)面作用。原因可能是高濃度的蘆丁螯合金屬離子數(shù)量多，進(jìn)入細(xì)胞后釋放出的金屬離子表現(xiàn)出促氧化的作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生自由基，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞活性。

4 結(jié) 論

蘆丁能夠通過(guò)提高細(xì)胞的抗氧化能力和抑制細(xì)胞凋亡來(lái)提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性。從本實(shí)驗(yàn)條件下，培養(yǎng)基中添加100 μg/mL 蘆丁的效果最佳。