張毅威, 桂林生, 郭文莉, 胡 言, 余橫偉, 楊武才, 昝林森, 趙春平
(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100)
SH2B銜接因子蛋白l(Src homology 2 B adaptor protein 1,SH2B1)屬于SH2B接頭蛋白家族,該家族蛋白含有SH2和PH結(jié)構(gòu)域[1]。SH2B1蛋白在小鼠的中樞神經(jīng)和外周組織中廣泛表達(dá),在脂肪和肌肉等組織中含量豐富[2]。研究發(fā)現(xiàn)SH2B1的SH2結(jié)構(gòu)域能夠與多種生長因子受體或細(xì)胞因子結(jié)合,其中包括胰島素受體(IR)、IR底物(IRS)1和2、Janus激酶(JAK)1和2,參與多種激素和多個(gè)細(xì)胞因子的信號通路,從而在生長發(fā)育、食欲、體重、代謝平衡、免疫調(diào)節(jié)等發(fā)面發(fā)揮著重要作用[3]。
近年來,國內(nèi)外在人和小鼠上開展了大量關(guān)于SH2B1基因功能的研究[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)完全敲除SH2B1基因的小鼠表現(xiàn)為胰島素抵抗、瘦素抵抗、脂肪代謝紊亂、葡萄糖耐受性喪失等一系列與肥胖癥相關(guān)的癥狀。如果讓SH2B1僅在小鼠神經(jīng)組織中表達(dá),則可逆轉(zhuǎn)這些肥胖相關(guān)的癥狀。如果讓SH2B1在神經(jīng)組織中過表達(dá),將明顯的緩解由HFD給藥所引起的瘦素抵抗和肥胖[2]。此外,Song等通過對SH2B1敲除小鼠進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)SH2B1缺失小鼠表現(xiàn)為代謝能力下降、生長發(fā)育遲緩、體型明顯變小、存活率降低、壽命變短等特征,表明SH2B1對代謝和生長亦有調(diào)控作用[1]。還有研究表明,SH2B1參與調(diào)控脂肪細(xì)胞分化,如果去除或者阻斷SH2B1的作用,將導(dǎo)致脂肪干細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞困難并妨礙脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的累積,表明SH2B1在脂肪細(xì)胞分化和脂肪沉積中發(fā)揮著作用[5-6]。SH2B1基因內(nèi)的多個(gè)SNP位點(diǎn)與肥胖密切相關(guān)。在人上,SH2B1基因上的5個(gè)完全連鎖的SNP與腰圍、體重、血清瘦素水平和體內(nèi)脂肪含量等顯著相關(guān)[7]。目前在家畜上也開展了SH2B1基因相關(guān)的研究。在探討SH2B1基因在牛生長發(fā)育等方面的作用中,楊明娟等分析了SH2B1基因在南陽牛等群體中的遺傳變異及其與生長性狀的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)SH2B1基因第2 795 bp處存在G>A的錯(cuò)義突變,導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸由Ala突變?yōu)門hr。關(guān)聯(lián)分析顯示,該突變位點(diǎn)與生長性狀顯著相關(guān),認(rèn)為該基因可作為南陽牛體尺、體重和日增重選擇的分子育種候選標(biāo)記[8]。
鑒于SH2B1基因在肥胖癥、脂肪代謝、生長發(fā)育中的重要作用,為深入探討該基因在中國黃牛的組織表達(dá)規(guī)律和遺傳多態(tài)性,本研究擬分析SH2B1基因在秦川牛不同組織中的相對表達(dá)量;此外,以4個(gè)中國地方黃牛品種為研究對象,包括秦川牛、郟縣紅牛、巴山牛和南陽牛,檢測SH2B1基因在4個(gè)黃牛群體中的多態(tài)性,并分析不同基因型對秦川牛體尺性狀的影響,以期為深入研究SH2B1的功能及分子標(biāo)記輔助選擇打下了基礎(chǔ),為秦川牛選育改良提供理論基礎(chǔ)。
采集3頭2周歲秦川牛的6種組織,包括腎臟、肝臟、背最長肌、小腸、脂肪、心臟。采集18~24月齡的4個(gè)地方黃牛品種共1 062頭的血樣,包括秦川牛476頭、郟縣紅牛335頭、巴山牛142頭、南陽牛109頭。對秦川牛進(jìn)行體尺測量,測定性狀包括體長(BL)、體高(WH)、腰高(HH)、臀長(RL)、坐骨端寬(HW)、胸深(CD)、胸圍(CC)[9]。
1.2.1 RNA的提取和組織表達(dá)的分析 采用TRIZOL試劑盒提取總RNA,再經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA[9]。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測基因表達(dá)。反應(yīng)體系總體積為20 μL,包括:2.0 μL cDNA(50 ng),0.8 μL上、下游引物(0.4 μmol/L),10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ,0.4 μL ROX reference dye和6 μL水。具體擴(kuò)增步驟為:95 ℃,30 s;然后95 ℃,5 s,40個(gè)循環(huán);最后60 ℃,45 s。每個(gè)樣品重復(fù)3次,β-actin作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算SH2B1基因的相對表達(dá)水平[10]。
1.2.2 基因組DNA的提取及檢測 本試驗(yàn)采用血液基因組DNA提取試劑盒提取包括秦川牛在內(nèi)的共1 062頭的血樣基因組DNA,提取后的 DNA用TE緩沖液溶解,采用0.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,測定DNA濃度后,-20 ℃保存?zhèn)溆肹9]。
1.2.3 引物設(shè)計(jì)合成及PCR擴(kuò)增 參照GeneBank中公布的牛SH2B1的序列(AC_000182.1),利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物見表1,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,PCR反應(yīng)體系30 μL,包括:含有核酸染料的dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×Buffer的Mix 15.0 μL,dd H2O 11.8 μL,10.0 μmol/L混合引物(上游引物和下游引物各10.0 pmol/μL)1.2 μL,模板DNA(50 ng/μL)2.0 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃,30 s,最適溫度退火30 s,72 ℃ 30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存,用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。
表1 牛SH2B1基因引物序列及相關(guān)信息
1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 運(yùn)用遺傳多樣性分析軟件(Genpop 32)統(tǒng)計(jì)各突變點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率,同時(shí)計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)、遺傳雜合度(He)和遺傳純合度(Ho)。使用SPSS 16.0軟件對不同位點(diǎn)基因型的分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡適應(yīng)性檢驗(yàn)[11]。
利用SPSS 19.0軟件檢驗(yàn)各基因座位的基因型頻率和秦川牛的體尺性狀指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性,數(shù)學(xué)模型為:
Yijm=μ+Gi+Aj+Sm+Eijm
(1)
式中:Yijlm為每頭牛測量的性狀;μ為性狀的平均值;Gi為與基因型相關(guān)固定效應(yīng);Ai為由于年齡造成的固定效應(yīng);Sm為父本的固定效應(yīng);Eijlm為隨機(jī)誤差[12]。
牛SH2B1基因位于25號染色體上,基因全長8 550 bp,含8個(gè)外顯子。參考NCBI數(shù)據(jù)庫中GenBank公布的牛SH2B1基因序列(AC_000182.1),對測序結(jié)果進(jìn)行DNA序列比對和突變位點(diǎn)分析,共檢測到2個(gè)SNP位點(diǎn),分別是在擴(kuò)增序列的第6 073位處發(fā)生一處單堿基C>T的突變(圖1),該SNP位于SH2B1基因第4內(nèi)含子區(qū)域;另外在序列第8 067位發(fā)生一處T>C突變(圖2),該SNP位于SH2B1基因的3′UTR區(qū)域。
圖1 多態(tài)位點(diǎn)C6073T序列圖
圖2 多態(tài)位點(diǎn)T8067C序列圖
SH2B1基因在秦川牛6種組織中表達(dá)情況分析結(jié)果見圖3。從圖3可以看出,SH2B1基因在各組織中呈泛表達(dá)狀態(tài),表明該基因在體組織中分布廣泛,其表達(dá)量從高到低依次為心臟、背最長肌、腎臟、脂肪、肝臟、小腸。
圖3 秦川牛SH2B1基因mRNA的組織表達(dá)分析
4個(gè)黃牛群體中SH2B1基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率和遺傳多態(tài)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。由表2可知,秦川牛群體中,SNP1和SNP2位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。在SNP1位點(diǎn)上,C和T等位基因的頻率分別為67.86%和32.14%;CC、CT、TT基因型頻率分別為48.32%,39.08%,12.61%;基因雜合度和有效等位基因分別是0.436 2和1.773 8。在SNP2位點(diǎn)上,T和C等位基因頻率分別為78.36%和21.64%;TT、TC、CC等位基因頻率分別為63.03%,30.67%,6.30%;基因雜合度和有效等位基因分別為0.339 1和1.513 1。秦川牛群體中SH2B1基因在2個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)信息含量分別為0.341 1和0.281 6,均屬于中度多態(tài)。
郟縣紅牛群體中,SH2B1基因在第1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)有3種基因型,即CC、CT和TT,他們的頻率分別為57.01%,32.24%,10.75%,等位基因C和T的頻率分別為73.13%和26.87%。該位點(diǎn)的多態(tài)信息含量、基因雜合度和有效等位基因數(shù)分別為0.315 8,0.393 0,1.647 3。因?yàn)?.25 巴山牛群體中,在SNP1上,C和T等位基因的頻率分別為69.37%和30.63%,CC、CT、TT基因型頻率分別為51.41%,35.92%,12.68%;在SNP2上,T和C等位基因頻率分別為76.76%和23.24%,TT、TC、CC基因型頻率分別為65.49%,22.54%,11.97%;巴山牛群SH2B1基因在2個(gè)SNPs位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.334 7和0.293 1,皆屬于中度多態(tài)。在第1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),在第2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg極不平衡狀態(tài)(P<0.01)。2個(gè)SNP位點(diǎn)的基因雜合度和有效等位基因數(shù)分別為0.425 0,1.739 1和0.356 8,1.554 7。 南陽牛群體中,在SNP1上,CC、CT、TT基因型頻率分別為48.62%,32.11%,19.27%;在SNP2上,TT、TC、CC基因型頻率分別為59.63%,32.11%,8.26%。Hardy-Weinberg的結(jié)果與巴山牛不同,在第1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg極不平衡狀態(tài)(P<0.01),而在第2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。南陽牛群SH2B1基因在2個(gè)SNPs位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.352 5和0.300 3,皆屬于中度多態(tài)。在SNP1,基因雜合度和有效等位基因分別是0.456 9和1.841 3,而在SNP2,這兩項(xiàng)指標(biāo)分別為0.368 0和1.582 3。 表2 SH2B1基因各多態(tài)位點(diǎn)在4種黃牛群體的基因型頻率 對秦川牛的7個(gè)體尺性狀進(jìn)行測定,并對SH2B1基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與體尺性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果(表3)表明,在C6073T多態(tài)位點(diǎn),CC型個(gè)體(n=230)在體長(BL)、腰高(HH)、坐骨端寬(HW)都顯著優(yōu)于TT型(P<0.05),而CC個(gè)體和TT型個(gè)體之間,胸圍(CC)差異極顯著(P<0.01)。此外,TT個(gè)體的坐骨端寬(HW)與其他個(gè)體之間差異也顯著(P<0.05),顯著小于CC和CT型。 對秦川牛的第2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(T8067C)和不同基因型之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,分析結(jié)果(表3)表明,TT型個(gè)體在體長(BL)這項(xiàng)指標(biāo)與TC型(n=146)差異不顯著,但CC型個(gè)體(n=30)與其他個(gè)體之間差異極顯著(P<0.01);體高(WH)這項(xiàng)指標(biāo),TT型與TC型個(gè)體對CC型個(gè)體差異顯著(P<0.05),CC型個(gè)體與其他個(gè)體間差異極顯著(P<0.01)。 表3 秦川牛SH2B1基因各多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析 注:同列數(shù)據(jù)后標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);同列數(shù)據(jù)后標(biāo)注不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。BL(體長),WH(體高),HH(腰高),RL(臀長),HW(坐骨端寬),CD(胸深),CC(胸圍)。 SH2B銜接因子蛋白l是一種信號分子,參與多種信號傳導(dǎo),在體內(nèi)能量代謝調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,SH2B1基因可以參與生長激素誘導(dǎo)的JAK2活化、延緩IR酪氨酸及IRS的去磷酸化、增強(qiáng)IRS的磷酸化[6,13-14]。SH2B1敲除鼠的實(shí)驗(yàn)表明,SH2B1對血糖、血脂、肥胖、胰島素、瘦素等具有重要的調(diào)節(jié)作用[15-16]。楊明娟等分析了SH2B1基因在中國黃牛群體中的遺傳變異及其與生長性狀的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)SH2B1基因上存在的錯(cuò)義突變與生長性狀顯著相關(guān),認(rèn)為該基因可作為中國黃牛生產(chǎn)性狀的分子育種候選標(biāo)記[8]。因此,本試驗(yàn)研究了秦川牛、郟縣紅牛、巴山牛和南陽牛4個(gè)中國地方品種SH2B1基因的多態(tài)性,在該基因的第4內(nèi)含子和3′UTR共發(fā)現(xiàn)了2個(gè)多態(tài)位點(diǎn),即C6073T和T8067C,這2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)處于中度多態(tài),因此,在生產(chǎn)中可以對SH2B1基因進(jìn)行進(jìn)一步加強(qiáng)選擇。進(jìn)行卡方檢驗(yàn)之后發(fā)現(xiàn)在C6073T多態(tài)位點(diǎn)上郟縣紅牛和南陽牛均處于Hardy-Weinberg極不平衡狀態(tài),這可能是經(jīng)過了長期選育以后造成的基因頻率的改變,也有可能是牛品種自身的原因,還有可能是不同地區(qū)人為對牛性狀的不同選育而造成的;相反巴山牛和秦川牛處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),說明在人工選育、遷徙和遺傳漂變等外界因素作用下,這個(gè)C6073T多態(tài)位點(diǎn)的基因型處于動(dòng)態(tài)平衡中[8]。 經(jīng)過長期選育以后,秦川牛等地方牛品種的生產(chǎn)性能得到了快速提高。此外,加大對特定基因的選擇強(qiáng)度必定成為提高秦川牛以及其他地方黃牛生產(chǎn)性狀的一個(gè)有效手段。SH2B1基因各突變位點(diǎn)不同基因型與秦川牛體尺的關(guān)聯(lián)性分析表明:C6073T位點(diǎn)與秦川牛的體長、髖高、坐骨端寬顯著相關(guān),對秦川牛的胸圍影響極顯著。而T8067C位點(diǎn)對于秦川牛體長,體高影響顯著,并且T8067C的顯性純合子相對于雜合子在體高方面影響顯著。通過對C6073T和T8067C 2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)有關(guān)于體長、體高、髖高、臀長、坐骨端寬、胸深、胸圍的體尺相關(guān)性分析后,筆者認(rèn)為,SH2B1基因可能是影響秦川牛體長的主效基因或與之緊密連鎖,可以嘗試把SH2B1基因作為秦川牛新品系培育的輔助選擇分子標(biāo)記。 測序和序列比對表明,2個(gè)SNPs位于內(nèi)含子區(qū)域和3′UTR區(qū)域,并未改變其編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。然而,最近的研究提供的證據(jù)表明,在3′UTR的基因突變可能通過影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯,從而有可能影響蛋白表達(dá)及表型[17-19]。例如,牛NUCB2基因上的2個(gè)無意突變與秦川牛和南陽牛的體尺及生長性狀顯著相關(guān)[20],OBR基因內(nèi)含子8上的2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與肉雞的腹脂重和腹脂率顯著相關(guān)[21],PAX3基因內(nèi)含子上的1個(gè)SNP與草原紅牛和南陽牛的體長和體高相關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)SH2B1基因的內(nèi)含子區(qū)域和3′UTR區(qū)域的突變,與秦川肉牛的體尺性狀顯著相關(guān),筆者推測這2個(gè)SNP位點(diǎn)可能對SH2B1蛋白表達(dá)、折疊或功能具有一定的影響。 在對秦川牛的不同組織進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR分析后,筆者發(fā)現(xiàn)SH2B1基因在各組織中廣泛表達(dá),表達(dá)量最高的組織是背最長肌和心臟組織,在小腸中表達(dá)量最少,在腎臟、肝臟與脂肪組織中表達(dá)量中等,這一結(jié)果表明該基因在牛組織中的表達(dá)情況和人上的類似[2],即在許多組織中廣泛表達(dá),這也與SH2B1參與多種信號途徑傳遞的功能相一致。 本試驗(yàn)只對秦川牛SH2B1基因與體尺指標(biāo)做了相關(guān)性分析,并沒有對郟縣紅牛、巴山牛和南陽牛SH2B1基因?qū)τ隗w尺指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,所以在秦川牛身上得出的結(jié)論是否可以推廣到其他3個(gè)地方品種的育種方面,還有待進(jìn)一步研究。 研究通過qPCR,對SH2B1基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析,并利用DNA測序技術(shù)在4個(gè)黃牛群體中檢測了SH2B1基因的多態(tài)性,結(jié)果表明該基因在秦川牛各組織中廣泛表達(dá)。此外在SH2B1基因的第4內(nèi)含子和3′UTR各發(fā)現(xiàn)了1個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn),分別是C6073T和T8067C,并分析了這2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在4個(gè)黃牛群體中的等位基因頻率、多態(tài)信息含量、基因雜合度、有效等位基因數(shù),進(jìn)行了哈溫伯格平衡檢驗(yàn)。在秦川牛群體中,就SH2B1基因各多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與體尺性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)型分析,結(jié)果表明這2個(gè)位點(diǎn)與秦川牛某些體尺性狀有顯著相關(guān)性。因此,SH2B1基因可以作為影響秦川牛生產(chǎn)性狀的遺傳標(biāo)記候選基因。2.4 SH2B1基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)突變與秦川牛體尺性狀的相關(guān)性分析
3 討 論
4 結(jié) 論