楊修鎮(zhèn) 陳玲 尹伶靈 張呈軍 牛華星 懂玲玲 吉利偉

高效液相色譜-串聯質譜法測定牛肉中泰拉霉素代謝物殘留量研究

楊修鎮(zhèn) 陳玲 尹伶靈 張呈軍 牛華星 懂玲玲 吉利偉

（山東省獸藥質量檢驗所 山東省畜產品質量安全監(jiān)測與風險評估重點實驗室 山東 濟南 250022） （山東舍里樂藥業(yè)有限公司 山東濟寧）

建立牛肉中泰拉霉素代謝物的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，色譜柱為C18(100mm× 2.1mm，1.7μm)，以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧離子源正離子檢測模式(ESI+)和多反應監(jiān)測(MRM)模式測定，基質匹配標準曲線法定量。結果表明，泰拉霉素代謝物進樣濃度在1~100ng/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系(r2=0.9999)；方法檢出限和定量限分別為10μg/kg和30μg/kg；定量限、1/2MRL、MRL和2MRL 4個添加水平下，回收率在70%~110%之間，相對標準偏差小于10%。本方法簡便、準確、快速、靈敏，適用于牛肉中泰拉霉素代謝物殘留量的檢測。

高效液相色譜-串聯質譜 牛肉 泰拉霉素代謝物

泰拉霉素是一種動物專用的新型半合成的大環(huán)內酯類抗生素，與其他許多大環(huán)內酯類抗生素不同的是，其具有3個堿性氨基基團，酸解離常數(pKa)分別為8.6、9.6、9.9，這些特征有利于穿通革蘭氏陰性菌的外膜[1]。研究表明[2, 3]，與泰樂菌素、替米考星、恩諾沙星和氟苯尼考等藥物相比，泰拉霉素具有抗菌活性強、藥物代謝動力學特征卓越、臨床療效好、減緩細菌耐藥性產生等優(yōu)點，在畜牧業(yè)中具有廣闊的應用前景。我國農業(yè)部在2008年第957號公告中首次批準進口泰拉霉素原料藥和泰拉霉素注射液在國內使用[4]。EMA[5]和FDA[6]以泰拉霉素代謝物CP-60300為代謝標示物，并通過每日允許最大攝入量和放射標記法殘留消除試驗規(guī)定了代謝標示物最大殘留限量?；诖吮疚膶εＨ庵刑├顾卮x標示物的殘留檢測方法進行了研究。

圖1 泰拉霉素代謝物化學結構式

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

高效液相-串聯質譜儀(Waters Xevo TQ-S)：配有電噴霧離子源(ESI)；電子天平(感量0.01g、0.00001g)；高速分散均質機(FJ-200)；多管渦旋振蕩器(VX-III)；離心機(CF16RXⅡ，轉速10000 r/min)；氮吹儀(N-EVAP-112)；有機濾膜(0.22 μm)；固相萃取儀裝置及MCX固相萃取柱(Waters公司)；泰拉霉素代謝物標準品(山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司自制，含量94.7%)；甲醇、甲酸為色譜純；鹽酸為優(yōu)級純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 標準溶液配制

精密稱取泰拉霉素代謝物標準品10mg，置10ml容量瓶中，用50%甲醇水溶液(含0.1%甲酸)溶解并稀釋至刻度，配制成濃度各為1mg/ml的標準貯備液。精密量取泰拉霉素代謝物貯備液100μl，置10ml容量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，v/v)稀釋至刻度，配制成濃度為10μg/ml的溶液，再精密量取100μl，置10ml容量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，v/v)稀釋至刻度，配制成濃度為1μg/ml的溶液。

1.3 前處理條件

1.3.1 提取 根據參考文獻[7]方法，稱取勻漿后的樣品1g(精確至0.01g)置50ml離心管中，加入2mol/L鹽酸4.5ml，渦旋1min，振蕩提取10min，置60℃水浴消化1h，10000r/min離心10min，收集上清液，下層加入2mol/L鹽酸4.5ml，重復提取一次，合并上清液，加水定容至10ml，精密量取1ml加水4ml渦旋混勻，備用。

1.3.2 凈化 MCX固相萃取柱依次用3ml甲醇和3ml水活化，取備用液全部過柱，再依次用0.1mol/L HCl、甲醇各3ml洗滌，抽干，用5%氨化甲醇5ml洗脫。洗脫液于50℃水浴氮氣吹干，殘余物中加甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，v/v)1ml渦旋1min復容，10000r/min離心5min，過0.22μm濾膜，濾液供液相色譜-串聯質譜測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：BEH C18(100mm×2.1 mm，1.7μm)；流動相：A相為0.1%甲酸甲醇溶液，B相為0.1%甲酸水溶液；流速：0.3ml/min；進樣量：5μl。柱溫：35℃；洗脫條件如表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.4.2 質譜條件 電離模式：電噴霧正離子(ESI+)，毛細管電壓：3.2kv，離子源溫度：150℃，脫溶劑溫度：450℃，脫溶劑氣流速：550L/Hr，錐孔反吹氣流速：50L/Hr；脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮，采集方式：多反應監(jiān)測(MRM)，泰拉霉素代謝物的定性、定量離子見表2。

表2 泰拉霉素代謝物特征離子參考質譜條件

2 結果與分析

2.1 方法的專屬性

選擇20個牛肉空白樣品按照1.3項方法處理后，在規(guī)定的測試條件下進行檢測，未發(fā)現有假陽性結果，表明該方法的專屬性良好。

2.2 基質效應

稱取牛肉空白樣品1g(精確至0.01g)，平行六份，按照1.3項方法處理至“洗脫液于50℃水浴氮氣吹干”。精密吸取濃度為1μg/ml的標準溶液100μl，置10ml容量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，v/v)稀釋至刻度，配制成濃度為10ng/ml的溶液，分別精密吸取1ml置空白樣品吹干的基質中，渦旋1min復容，10000r/min離心5min，過0.22μm濾膜，在規(guī)定的測試條件下進行檢測，所得面積均值和RSD如表3所示。結果表明，牛肉基質標準品溶液與溶劑標準品溶液相比有明顯的基質抑制作用，因此，后續(xù)試驗均采用基質匹配標準曲線進行定量校正。

圖2 牛肉空白樣品

圖3 牛肉空白樣品添加30μg/kg

表3 基質效應 (ng·ml-1、%)

2.3 線性范圍

精密吸取1μg/ml的標準工作液，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，v/v)配制濃度為1、2、4、10、40、100ng/ml的系列標準溶液，精密吸取1ml分置空白樣品吹干的基質中，渦旋1min復容，10000 r/min離心5min，過0.22μm濾膜，在規(guī)定的測試條件下進行檢測，以泰拉霉素代謝物定量離子峰面積為縱坐標，泰拉霉素代謝物濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：y=3415.6x-578.65，曲線的R2為0.9999，在1~100ng/ml濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.4 方法的靈敏度

在牛肉空白樣品中添加泰拉霉素代謝物標準溶液，1.3項方法處理后，在規(guī)定的測試條件下進行檢測，計算信噪比。滿足歐盟657號決議[8]規(guī)定的定性條件的最低添加量為本方法的檢出限，大于檢出限，定量離子色譜峰的信噪比(S/N)滿足在10：1以上且回收率滿足70%~110%之間的最低添加量為本方法的定量限[9]。本方法的檢出限為10μg/kg，定量限為30 μg/kg。

2.5 方法的準確度和精密度

取3批牛肉空白樣品，每批中添加泰拉霉素代謝物30μg/kg(LQD)、150μg/kg(1/2MRL)、300 μg/kg(MRL)、600μg/kg(2MRL)4個不同濃度，每個濃度平行5份，1.3項方法處理后，在規(guī)定的測試條件下進行檢測，計算回收率，回收率在70%~ 110%之間，批內、批間相對標準偏差均小于10%，結果見表4。

表4 方法準確度與精密度 (μg·㎏-1、%)

2.6 100批樣品檢測結果

從農貿市場隨機購買的100批牛肉按照本研究建立的方法進行檢測，結果均有3批檢出泰拉霉素代謝物，其中1批低于定量限，另外兩批分別為36.4μg/kg、48.2μg/kg，遠低于最大殘留限量。

3 討論與小結

（1）前處理過程中提取時嘗試了多種提取液，包括乙腈、甲醇、水、鹽酸溶液，測試結果表明，泰拉霉素代謝物極性較大且具有堿性，在鹽酸溶液中的提取率最高，依據參考文獻[7]選用2 mol/L鹽酸消化處理后干擾物明顯減少。MCX固相萃取柱具有反相和陽離子交換雙重保留性能，對堿性化合物具有良好的保留能力，凈化后基線更為平直，回收率大大提高。（2）泰拉霉素作為一種新藥，其在畜禽產品中的殘留研究報道較少，劉勇軍等[10]建立了高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)測定豬肉樣品中泰拉霉素殘留的方法，徐曹燕等[11]建立了雞組織中泰拉霉素殘留的檢測方法，檢測的都是泰拉霉素原型，而目前沒有關于泰拉霉素原型的最大殘留限量規(guī)定。國內通過檢測泰拉霉素代謝標志物來檢測組織中泰拉霉素殘留的研究較少，本方法用2 mol/L鹽酸消化提取，MCX固相萃取柱凈化，高效液相色譜-串聯質譜正離子模式測定，結果泰拉霉素代謝物在牛肉中的檢測限為10μg/kg、定量限為30μg/ kg，遠低于最大殘留限量，滿足殘留檢測要求。整個實驗過程簡單、快速，回收率較高，精密度好，適用于牛肉中泰拉霉素代謝物殘留量的檢測。

[1] 張剛, 郭麗清, 徐金雷等. 泰拉霉素的研究進展[J]. 北京聯合大學學報, 2017, 31(2): 48-53.

[2] Kilgore W R, Spensley M S, SUN F S, et al. Therapeutic efficacy of tulathromycin, a novel triamilide antimicrobial, against bovine respiratory disease in feeder calves[J]. Veterinary Therapeutics, 2005, 6(2): 143-53.

[3] Nautrup B P, Van Vlaenderen I, Gasper S, et al. Estimating the comparative clinical and economic consequences of tulathromycin for treatment of present or anticipated outbreaks of bovine respiratory disease in feedlot cattle in the United States[J]. Journal of Animal Science, 2013, 91(12): 5868-5877.

[4] 農業(yè)部. 中華人民共和國農業(yè)部公告第957號[S]. 2008.

[5] Ema. Scientiric Discussion[S]. CVMP/0968/03, 2003.

[6] Fda. Freedom of Information Summary[S]. Nana 141-244, 2005.

[7] Cox S R, Mclaughlin C, Fielder A E, et al. Rapid and Prolonged Distribution of Tulathromycin into Lung Homogenate and Pulmonary Epithelial Lining Fluid of Holstein Calves Following a Single Subcutaneous Administration of 2.5 mg/kg Body Weight[J]. International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine, 2010, 8(3): 129-37.

[8] Commission Decision(EC) No 657/2002 of the European parliament and of the council[S].

[9] 吳劍平, 張婧, 貢松松等. 分散固相萃取結合液相色譜串聯質譜法檢測?？墒承越M織中太地羅新殘留量[J]. 中國獸藥雜志, 2019, 25(3): 37-46.

[10] 劉勇軍, 吳銀良, 姜艷彬等. 高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中泰拉霉素殘留[J]. 分析化學研究簡報, 2009, 37(10): 1489-1493.

[11] 徐曹燕, 李琳, 湯春蓮等. 雞組織中泰拉霉素殘留的高效液相色譜-串聯質譜測定法[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版), 2016, 44(6): 16-22.

（2019–05–20）

S818.9

A

1007-1733(2019)09-0001-04