田 舍， 江建新， 喻 超， 李 琳， 孫誠誼△

(1貴州醫(yī)科大學(xué)， 2貴州醫(yī)科大學(xué)肝膽胰脾重點(diǎn)實(shí)驗室， 貴州 貴陽 550001；3武漢大學(xué)人民醫(yī)院， 湖北省人民醫(yī)院， 湖北 武漢 430000)

胰腺癌在世界腫瘤排名中為第7位，是惡性程度較高的實(shí)體腫瘤之一，發(fā)生隱匿、發(fā)展迅速，明確診斷時往往已經(jīng)是進(jìn)展期，5年生存率低于5%[1-2]；隨著前沿科技不斷運(yùn)用于臨床，針對胰腺癌患者的系統(tǒng)治療方案不斷改善，但是臨床治療效果并沒有明顯提高，約40%的新診斷胰腺癌患者均發(fā)現(xiàn)有不同程度的轉(zhuǎn)移，喪失了最佳手術(shù)時間，只能采取姑息性治療[3-4]。全球的學(xué)者們從胰腺腫瘤生物學(xué)特性及其發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制發(fā)生、發(fā)展的分子靶點(diǎn)為突破口，為尋找治療胰腺腫瘤的分子治療靶點(diǎn)。

哺乳動物沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2，Sir2)最早在酵母菌中被發(fā)現(xiàn)，后來逐漸發(fā)現(xiàn)在自然界生物中廣泛的表達(dá)。Sir2作為組蛋白去乙?；割悾ㄟ^調(diào)控下游結(jié)合蛋白的去乙?；絹韰⑴c細(xì)胞內(nèi)多個重要信號通路，如能量代謝、脂類代謝和胰島素分泌等。Sir2家族中研究最多的是SIRT1；目前為止的研究中發(fā)現(xiàn)多個重要信號通路的樞紐蛋白與SIRT1相互作用；更多的研究指出SIRT1在腫瘤代謝和營養(yǎng)調(diào)節(jié)中有著極其重要的作用；現(xiàn)在的證據(jù)顯示腫瘤細(xì)胞中經(jīng)過上調(diào)SIRT1的表達(dá)及活性來提高胞內(nèi)NAD+數(shù)量來應(yīng)對腫瘤的生存和增殖。

本研究中，我們將SIRT1小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)和過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到胰腺癌Panc-1細(xì)胞中，敲減和過表達(dá)SIRT1基因，研究其對于胰腺癌細(xì)胞自噬能力的影響，并分析 SIRT1對FOXO1/RAB7信號通路的調(diào)控作用，初步探討相關(guān)分子機(jī)制，為尋找胰腺癌治療相關(guān)的分子靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和試劑

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1由武漢華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院膽胰實(shí)驗室惠贈。高糖DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清購自Gibco；RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；LC3雙標(biāo)腺病毒購自漢恒生物科技(上海)有限公司；SIRT1siRNA(si-SIRT1)設(shè)計及構(gòu)建由廣州銳博公司完成；鼠抗人SIRT1抗體及兔抗人p62、FOXO1和RAB7抗體購Cell Signaling Technology；鼠抗人GAPDH和histone H3抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗及高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；細(xì)胞裂解液、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和DAPI染料購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；Protein A/G 瓊脂糖珠購自Santa Cruz。pFlag-FOXO1和 pHA-SIRT1質(zhì)粒由本實(shí)驗室構(gòu)建。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每隔24 h換液1次，待細(xì)胞密度為80%時，常規(guī)進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞培養(yǎng)分2組：對照組細(xì)胞于37 °C、5% CO2、95%空氣在恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；實(shí)驗組細(xì)胞于37 °C、5% CO2、94% N2、1% O2三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行低氧培養(yǎng)12 h。選取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔1×105個，利用RNAiMAX試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.2總細(xì)胞蛋白的提取 常規(guī)消化離心收集細(xì)胞，用碧云天RIPA裂解液(強(qiáng))提取總蛋白。

2.3胞核蛋白的提取 將Panc-1細(xì)胞接種到 60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 分為 pHA-SIRT1組和 si-SIRT1組，按上述分組轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒和siRNA至Panc-1細(xì)胞， 培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞并加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑， 放置冰上裂解 10 min，4 ℃、12 000×g離心 10 min 后吸棄上清液，加入細(xì)胞核蛋白抽提試劑。每隔1～2 min高速劇烈振蕩15～30 s，共30 min。4 ℃ (12 000～16 000)×g離心10 min，上清即為所需胞核蛋白。

2.4Western blot法檢測目的蛋白的表達(dá) 半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2 h。依次加入特異性 I 抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，于Bio-Rad凝膠成像儀中進(jìn)行顯影。根據(jù)曝光結(jié)果進(jìn)行定性分析，以上實(shí)驗重復(fù)3次。

2.5免疫共沉淀實(shí)驗 常規(guī)收集細(xì)胞后裂解細(xì)胞，加入1 μg小鼠抗SIRT1單克隆抗體，4 °C旋轉(zhuǎn)混合2 h，加入20 μL蛋白A，繼續(xù)混合過夜，離心后吸棄上清，裂解液洗滌3次后加入5 μL 5× Tricine SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5 min，離心后立即電泳。

2.6細(xì)胞免疫熒光檢測 (1)將低氧培養(yǎng)的Panc-1細(xì)胞用4 ℃、含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(phosphate buffer，PB)固定，加入鼠抗SIRT1(1 ∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)漂洗后加入羊抗鼠Cy3熒光 II 抗，室溫下避光孵育 2 h。漂洗后用熒光封片劑(0.01 mol/L PBS 和甘油1 ∶1)封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。(2)通過感染mRFP-GFP-LC3 (Ad-tf-LC3)腺病毒，并定量mRFP-GFP-LC3熒光點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對自噬體的檢測。定量單個細(xì)胞熒光斑的表達(dá)；計算50個細(xì)胞的熒光斑，再計算平均每個轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光斑數(shù)量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間的均值比較用單因素方差分析法；SIRT1敲減或過表達(dá)組與對照組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗； SIRT1與FOXO1/RAB7信號通路關(guān)鍵因子的相關(guān)性分析采用 Pearson直線相關(guān)分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SIRT1在低氧誘導(dǎo)的自噬胰腺癌Panc-1核內(nèi)的表達(dá)情況

免疫熒光顯示，相比對照組0 h，SIRT1在低氧誘導(dǎo)的胰腺癌Panc-1細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯增加，見圖1A。Western blot 檢測顯示，SIRT1在Panc-1細(xì)胞核中隨低氧時間增加總體呈現(xiàn)逐漸表達(dá)增加的趨勢(P<0.05),見圖1B。

Figure 1.The expression of SIRT1 in pancreatic cancer cell nucleus induced by hypoxia. A: immunofluorescence staining; B: Wes-tern blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

圖1 SIRT1在低氧誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞核中的表達(dá)情況

2 敲減或過表達(dá)SIRT1對低氧誘導(dǎo)的胰腺癌Panc-1細(xì)胞自噬的影響

Western blot 法檢測SIRT1敲減和過表達(dá)效果，見圖2。敲減SIRT1后胰腺癌Panc-1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)增多，且p62降解受到抑制(P<0.05)；而當(dāng)SIRT1過表達(dá)時，LC3-II表達(dá)變化的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，但是p62的降解受到明顯抑制(P<0.05)，見圖3。同時通過熒光顯微鏡觀測雙色熒光標(biāo)記的LC3蛋白在低氧誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，下調(diào)SIRT1后自噬溶酶體(紅色熒光點(diǎn))數(shù)量明顯增加(P<0.05)，而自噬小體(黃色熒光點(diǎn))變化的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖4。

3 敲減或過表達(dá)SIRT1對FOXO1/RAB7信號通路的影響

Western blot 檢測顯示，過表達(dá)SIRT1后，F(xiàn)OXO1/RAB7信號通路蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05); 敲減SIRT1的表達(dá)能夠顯著降低FOXO1/RAB7信號通路蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)，抑制FOXO1/RAB7信號通路，見圖5。

4 生物信息學(xué)分析SIRT1與FOXO1的相關(guān)性

通過GEPIA網(wǎng)站進(jìn)行SIRT1與其它蛋白的關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果顯示SIRT1與FOXO1顯著相關(guān)(P<0.05)，提示 SIRT1與自噬信號通路可能存在密切關(guān)系，見圖6。

5 胰腺癌細(xì)胞中SIRT1與FOXO1蛋白存在相互作用

在胰腺癌Panc-1細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染 pHA-SIRT1和pFlag-FOXO1質(zhì)粒，通過蛋白免疫共沉淀實(shí)驗檢測SIRT1與FOXO1蛋白之間的相互作用情況，結(jié)果顯示Panc-1細(xì)胞中SIRT1與FOXO1存在相互作用，見圖7。

Figure 2.The over-expression and knock-down ofSIRT1expression at protein levels in the Panc-1 cells were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-NC group;#P<0.05vspHA-SIRT1 group.

圖2 Western blot檢測胰腺癌Panc-1細(xì)胞敲減或過表達(dá)SIRT1的效果

Figure 3.The effects ofSIRT1over-expression and knock-down on the autophagy in the Panc-1 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-NC group;#P<0.05vspHA-SIRT1 group.

圖3 敲減或過表達(dá)SIRT1對于胰腺癌Panc-1細(xì)胞自噬的影響

Figure 4.The effect ofSIRT1expression knock-down on autolysosome production in the Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-NC group.

圖4 敲減SIRT1的表達(dá)對于自噬溶酶體生成的影響

Figure 5.The effects of SIRT1 expression levels on the protein expression of FOXO1/RAB7 signaling pathway-related molecules. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-NC group;#P<0.05vspHA-NC group.

圖5 SIRT1表達(dá)水平對FOXO1/RAB7信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

討 論

腫瘤缺氧微環(huán)境是人類惡性實(shí)體腫瘤的基本特征之一，腫瘤缺氧與其惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[5]。

Figure 6.The correlations between SIRT1 and FOXO1 were analyzed in GEPIA database．

圖6 生物信息學(xué)分析SIRT1與FOXO1信號通路關(guān)鍵因子的相關(guān)性

人體的大部分組織中，氧濃度在3～5%之間，當(dāng)氧濃度處于3%以下即視為低氧環(huán)境[6]。臨床研究中通過18F-FAZA輔助PET圖像證實(shí)胰腺癌缺氧分?jǐn)?shù)在5～50%之間[7]，瘤體內(nèi)呈低氧氣張力，表明胰腺癌處于低氧環(huán)境，具有缺血缺氧的病理生理特點(diǎn)。缺氧與胰腺癌的發(fā)展進(jìn)程及惡性生物學(xué)特性密切相關(guān)[8-9]。SIRT1是Sir2家族中的成員之一。SIRT1作為一種重要的能量調(diào)控蛋白，連接著細(xì)胞代謝和核染色質(zhì)；作為NAD+依賴型去乙?；福ㄟ^調(diào)控組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子，從而參與到細(xì)胞衰老、凋亡、DNA損傷修復(fù)和自噬等生理活動中[10]。叉頭框蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族中O亞家族中的FOXO1在人體心臟細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝臟細(xì)胞和腦神經(jīng)中有著大量的表達(dá)。研究表明，SIRT1-FOXO家族信號通路對衰老、肥胖、腫瘤及血管應(yīng)激損傷有著重要的影響[11]。SIRT1對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控具有雙重意義，特別是SIRT1通過多個信號通路影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和生存[12]。

Figure 7.SIRT1 interacted with FOXO1 at the protein level in the Panc-1 cells determined by co-immunoprecipita-tion．

圖7 胰腺癌細(xì)胞中SIRT1與FOXO1蛋白存在相互作用

細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)時，F(xiàn)OXO1被激活，F(xiàn)OXO1與Atg7和E1蛋白結(jié)合，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的自噬[13]。此外，非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)轉(zhuǎn)錄因子XBP-1u可促進(jìn)FOXO1的降解。但Ying 等[14]的研究表明，F(xiàn)OXO1的降解受到抑制可過度激活自噬，降低腫瘤細(xì)胞活性。

我們通過共聚焦熒光顯微鏡及Western blot實(shí)驗發(fā)現(xiàn)SIRT1隨著胰腺癌細(xì)胞自噬的進(jìn)程，逐漸在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)增加。當(dāng)通過轉(zhuǎn)染手段抑制細(xì)胞內(nèi)SIRT1的表達(dá)時，Panc-1細(xì)胞出現(xiàn)自噬受到抑制的表現(xiàn)。并且從LC3雙色熒光標(biāo)記蛋白的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，SIRT1通過FOXO1/RAB7信號通路，調(diào)控胞內(nèi)自噬小體及溶酶體的結(jié)合，使得自噬溶酶體大量在胞內(nèi)堆積，降解困難。同時通過生物信息學(xué)及免疫共沉淀證實(shí)SIRT1通過結(jié)合FOXO1，并調(diào)控FOXO1的去乙?；潭冗M(jìn)而調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞自噬。

綜上所述，低氧環(huán)境能夠引起SIRT1的入核，通過FOXO1/RAB7調(diào)控胰腺腫瘤細(xì)胞自噬。通過下調(diào)SIRT1的表達(dá)可以在低氧條件下抑制胰腺腫瘤細(xì)胞的自噬，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)FOXO1的乙酰化/去乙?；嘘P(guān)，但此信號通路具體作用機(jī)制還不甚清楚，需要進(jìn)一步的研究，并且該基因可能是除常規(guī)治療方法外的新的基因靶點(diǎn)。