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      熱休克轉(zhuǎn)錄因子1在AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用*

      2019-09-23 01:06:52宗佩君劉珊珊
      中國(guó)病理生理雜志 2019年9期
      關(guān)鍵詞:內(nèi)皮細(xì)胞硬化誘導(dǎo)

      劉 瑋, 宗佩君, 劉珊珊

      (1濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院病理教研室, 山東 青州 262500; 2濰坊市益都中心醫(yī)院病理科, 山東 濰坊 261000)

      動(dòng)脈粥樣硬化是一種涉及腦動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈等血管組織損傷的病理過程,其可以誘發(fā)血管管壁破裂、管腔閉塞等導(dǎo)致心肌梗死和中風(fēng)等疾病的發(fā)生,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生于動(dòng)脈粥樣硬化的早期,血管內(nèi)皮細(xì)胞過度凋亡是造成血管組織正常功能缺失的重要原因,另外,血管內(nèi)皮細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化過程中分泌大量的炎癥因子,這些炎癥因子可以刺激正常的組織和細(xì)胞,加快動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[1-3]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock tran-scription factor 1,HSF1)是存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的HSF亞型,其是調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其不僅參與熱休克反應(yīng),還參與組織發(fā)育和生殖等過程,HSF1具有抗炎、抗凋亡等作用,HSF1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中代償性的高表達(dá),HSF1具有降低氧化應(yīng)激條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用,在內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷中發(fā)揮保護(hù)作用,對(duì)于HSF1在血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用尚不明確[4]。本實(shí)驗(yàn)通過上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中HSF1的表達(dá)水平,探討HSF1在AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用,為明確HSF1在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用奠定基礎(chǔ)。

      材 料 和 方 法

      1 材料

      人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC-2購(gòu)自ATCC??笻SF1抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測(cè)試劑盒和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBioscience;pcDNA3.1-HSF1由廣州輝駿生物科技有限公司構(gòu)建;抗CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologus protein,CHOP)抗體、抗cleaved caspase-3抗體和抗活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)抗體購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司;一氧化氮(nitric oxide,NO)檢測(cè)試劑盒、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)含量檢測(cè)試劑盒和內(nèi)皮素1(endothelin-1,ET-1) 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche;AngⅡ購(gòu)自Sigma。

      2 方法

      2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM中。血管內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1,記為pcDNA3.1組和pcDNA3.1-HSF1組;用含有10-5mol/L的AngⅡ細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1的血管內(nèi)皮細(xì)胞,記為pcDNA3.1+AngⅡ組和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ組;用含有10-5mol/L的AngⅡ細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)未做轉(zhuǎn)染的血管內(nèi)皮細(xì)胞記為AngⅡ組;把0 mol/L的AngⅡ細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的未做轉(zhuǎn)染的血管內(nèi)皮細(xì)胞記為對(duì)照(control)組。各組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1轉(zhuǎn)染方法同Lipofectamine2000,用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

      2.2過表達(dá)效果的檢測(cè) RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平:control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1各組細(xì)胞按照細(xì)胞RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA,按照SYBR RT-qPCR試劑盒進(jìn)行PCR,HSF1的上游引物序列為5′-GGAAAGCTGTCCGCTGATGG-3′, 下游引物序列為5′-GCTGGAGATGGAGCTGAGTA-3′。β-actin的上游引物序列為5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′, 下游引物序列為5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。結(jié)果按照2-ΔΔCt法計(jì)算,以β-actin作為內(nèi)參照。

      Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平:control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1各組細(xì)胞用含有PMSF的RIPA裂解液提取蛋白以后,經(jīng)BCA法對(duì)蛋白樣品定量,進(jìn)行SDS-PAGE,每個(gè)泳道添加20 μg蛋白樣品,在濃縮膠中的電壓為100 V,觀察染料到達(dá)分離膠和濃縮膠的交接處,把電壓調(diào)整到120 V,觀察染料進(jìn)入底部邊緣,停止電泳。進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜電壓設(shè)置為90 V,轉(zhuǎn)膜80 min后,把NC膜取出,經(jīng)5%牛血清白蛋白室溫封閉以后,與抗HSF1和內(nèi)參照β-actin的抗體反應(yīng)后,與HRP標(biāo)記的 II 抗反應(yīng),經(jīng)ECL法顯色后,根據(jù)灰度值分析HSF1表達(dá)水平??笻SF1的抗體稀釋倍數(shù)為1∶400,抗β-actin抗體的稀釋倍數(shù)為1 ∶1 000。

      2.3LDH、NO和ET-1分泌水平的檢測(cè) 將control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h以后,收集培養(yǎng)液上清,分別檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH(二硝基苯肼法)、NO(硝酸還原酶法)和ET-1(ELISA法)水平,步驟均同試劑盒說明書。

      2.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 將control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h以后,收集細(xì)胞,以500 μL的結(jié)合緩沖液懸浮后,添加PI和annexin V-FITC染液,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡變化。

      2.5細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β水平的檢測(cè) 將control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h以后,收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清,用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-1β的水平,步驟同試劑盒操作說明。

      2.6細(xì)胞中CHOP、ATF6和cleaved caspase-3蛋白水平檢測(cè) 將control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h以后,用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中CHOP、ATF6和cleaved caspase-3的蛋白水平,步驟同2.2。

      3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組差異比較用單因素方差分析,組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      結(jié) 果

      1 pcDNA3.1-HSF1提高血管內(nèi)皮細(xì)胞中HSF1的表達(dá)水平

      轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HSF1能夠明顯提高血管內(nèi)皮細(xì)胞中HSF1的mRNA和蛋白表達(dá)水平(P<0.05),見圖1。

      Figure 1.The expression of HSF1 at mRNA and protein levels in transfected vascular endothelial cells. A: the mRNA expression of HSF1 was detected by RT-qPCR; B: the protein expression of HSF1 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1 group and control group.

      圖1 HSF1在轉(zhuǎn)染后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)

      2 過表達(dá)HSF1減少AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌LDH

      AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的LDH增多;過表達(dá)HSF1后的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后,細(xì)胞分泌的LDH減少(P<0.05),見表1。HSF1具有降低AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用。

      3 HSF1對(duì)AngⅡ處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO和ET-1水平的影響

      AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NO含量降低,ET-1含量升高;高表達(dá)HSF1后的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后,細(xì)胞分泌的NO含量升高,ET-1含量降低(P<0.05),見表1。HSF1具有改善AngⅡ處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管活性物質(zhì)的作用。

      表1 過表達(dá)HSF1的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后細(xì)胞分泌LDH、NO 與ET-1水平的比較

      Table 1.The effects of HSF1 over-expression on the secretion of LDH, NO and ET-1 in vascular endothelial cells induced by Ang II (Mean±SD.n=3)

      GroupLDH (U/L)NO (μmol/L)ET-1 (ng/L) Control81.45±8.320.47±0.0650.41±6.32 AngⅡ225.48±17.26*0.20±0.02*95.26±7.51* pcDNA3.1+AngⅡ217.40±22.810.19±0.0394.20±8.32 pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ125.87±10.95&0.36±0.03&75.36±6.20&

      *P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

      4 過表達(dá)HSF1降低AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平

      AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平升高;過表達(dá)HSF1后的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后,細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平降低(P<0.05),見圖2。HSF1可降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡水平。

      Figure 2. The effects of HSF1 over-expression on the apoptosis of vascular endothelial cells induced by Ang II. A: the results of flow cytometry for analyzing the effect of HSF1 over-expression on Ang II-induced apoptosis of vascular endothelial cells; B: the results of Western blot for determining the effects of HSF1 over-expression on the protein level of cleaved caspase-3 in vascular endothelial cells induced by Ang II. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

      圖2 過表達(dá)HSF1的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后細(xì)胞的凋亡情況

      5 過表達(dá)HSF1減少AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β

      AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β增多;過表達(dá)HSF1后的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后,細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β減少(P<0.05),見表2。HSF1具有降低AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎癥因子的作用。

      表2 過表達(dá)HSF1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響

      Table 2.The effects of HSF1 over-expression on the levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β secreted by vascular endothelial cells after Ang II induction (Mean±SD.n=3)

      GroupTNF-α (ng/L)IL-6 (ng/L)IL-1β (ng/L) Control332.47±25.159.82±0.961 542.69±158.20 AngⅡ528.14±62.85*35.20±3.59*2 178.63±163.18* pcDNA3.1+AngⅡ520.17±55.8236.81±4.922 165.04±147.53 pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ410.25±41.87&20.58±3.20&1 856.22±114.10&

      *P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

      6 HSF1減少AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中CHOP和ATF6蛋白表達(dá)

      AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中CHOP和ATF6蛋白水平增多;過表達(dá)HSF1后的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后,細(xì)胞中CHOP和ATF6蛋白水平減少(P<0.05),見圖3。HSF1具有抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。

      Figure 3.The effects of HSF1 over-expression on the protein levels of CHOP and ATF6 in vascular endothelial cells after Ang II induction. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

      圖3 過表達(dá)HSF1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后細(xì)胞中CHOP和ATF6蛋白水平的影響

      討 論

      動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是一種慢性的炎性、免疫性疾病,其與內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞損傷有關(guān),AngⅡ是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的促進(jìn)因子,其可以造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,誘導(dǎo)血管組織功能異常[5-6]。AngⅡ能夠增加血管內(nèi)皮的通透性,引起細(xì)胞因子和炎癥因子等的表達(dá),滅活NO,引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡發(fā)生[7]。ET-1和NO是維持血管功能的細(xì)胞因子,內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí),舒血管物質(zhì)NO分泌水平減少,而縮血管物質(zhì)ET-1分泌水平增加[8-10]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中釋放的LDH水平升高,分泌的NO含量降低,ET-1分泌水平升高,說明AngⅡ能夠引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。

      血管內(nèi)皮細(xì)胞過度凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要原因之一,AngⅡ作為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的誘導(dǎo)因子,其可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,致使血管組織完整性受到破壞[11]。Caspase是參與細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵蛋白家族之一,其可以被細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活,誘導(dǎo)caspase蛋白成員激活,促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生,caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子,其位于caspase凋亡反應(yīng)的下游,caspase-3活化水平的高低是細(xì)胞凋亡水平的標(biāo)志[12-13]。CHOP和ATF6是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白,二者表達(dá)水平升高可以激活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,誘導(dǎo)caspase凋亡反應(yīng)發(fā)生[14-15]。HSF1的抗細(xì)胞凋亡作用目前在腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中已經(jīng)被證實(shí)[16-18]。本研究顯示,高表達(dá)HSF1的血管內(nèi)皮細(xì)胞在AngⅡ處理后,細(xì)胞凋亡減少,細(xì)胞中活化的caspase-3蛋白水平降低,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP和ATF6表達(dá)水平也下降,說明HSF1能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

      炎癥因子是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的促進(jìn)因子,血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等都可以分泌炎癥因子,動(dòng)脈粥樣硬化時(shí),過量的炎癥因子可以損傷周圍的正常組織和細(xì)胞,引起細(xì)胞凋亡發(fā)生[19-20]。TNF-α、IL-6和IL-1β等細(xì)胞因子具有促進(jìn)炎癥的作用,其在動(dòng)脈粥樣硬化組織中表達(dá)上調(diào),AngⅡ能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎癥因子[21]。研究顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,還可以誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)[22]。HSF1是一種重要的炎癥調(diào)控因子,在巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抑制作用[20-23]。本研究顯示,高表達(dá)HSF1的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后,細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β減少,HSF1具有抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子分泌的作用。

      總之,HSF1在AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用,高表達(dá)HSF1能夠減少AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌,作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。HSF1在動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮抑制作用,對(duì)于其具體的作用機(jī)制尚不清楚,在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)進(jìn)行深入探討。

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