楊宇平，許 良，徐春娜，蒲首丞，孫梅好

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

茶作為一種健康自然飲品，受到人們的歡迎，白茶是輕發(fā)酵茶類，是我國特有品種[1]。安吉白茶是一種自然突變綠茶，是我國的珍稀茶樹品種，安吉白茶中富含大量具有生理功能的物質(zhì)，如茶多酚和茶多糖[2-3]。茶多糖是一類復合多糖，易溶解在熱水中，幾乎不溶于有機溶劑，但在高溫和較強的酸堿環(huán)境中容易降解導致生物學活性喪失[4-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，茶多糖是茶葉中又一種具有重要生理活性的物質(zhì)，擁有防治心血管疾病[6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8]、降血糖[9]及免疫調(diào)節(jié)[10]等多種功能。安吉白茶在醫(yī)學、養(yǎng)生上有較高的價值，對其成分的研究尤其是茶多糖的研究有著廣闊的前景[11]。故而一種簡單、高效的茶多糖提取方法對于茶多糖的研究具有十

分重要的作用。現(xiàn)階段，國內(nèi)外對茶多糖的提取方法主要有熱水浸提法、酶提取法、超聲波輔助提取法、超臨界CO2提取法等[4，12]。其中，運用了超聲波空化效應的超聲波輔助提取法[12]具有耗時短、反應條件相對溫和、能耗低和效率高的特點。而蒽酮-硫酸法等這類間接檢測多糖的方法，因具有操作簡便、實用性較強等優(yōu)勢而被廣泛運用[13]。

對于茶多糖提取的具體條件，已經(jīng)有很多學者進行了研究。陳朝銀等[14]通過試驗發(fā)現(xiàn)，隨著料液比的增大，茶多糖得率呈升高的趨勢；當料液比達到1∶30（g/mL）后，升高趨勢變緩慢；當料液比大于1∶40（g/mL）時，就不再發(fā)生明顯的變化。周宇波等[15]研究結(jié)果表明，隨著料液比的增大，茶多糖的提取得率先增加后減少，且在料液比1∶20（g/mL）時得率最高，達到108.45 mg/g。細胞中物質(zhì)浸出方式包括簡單擴散和受細胞膜結(jié)構(gòu)控制的主動轉(zhuǎn)運。由于多糖主要以簡單擴散的方式進出細胞，所以，溶劑量的增大可以提高濃度差的推動力，從而加快其溶出。但是同時要考慮到，細胞中其他物質(zhì)溶出的概率也相應變大，將會降低茶多糖提取得率。而且料液比越大，后期離心、過濾等處理步驟損失的茶多糖含量就越大。同時過多的溶劑也會對后續(xù)純化步驟帶來較多不便。尚進等[16]研究結(jié)果表明，在逐步延長超聲時間的條件下，茶多糖得率也跟著上升，并在120 min 時達到最高，之后茶多糖得率又逐漸下降。周宇波等[15]研究結(jié)果表明，隨著提取時間的延長，茶多糖得率先略有上升再下降，在60 min的條件下得率最高，可以達到109.75 mg/g，之后增加提取時間反而會導致得率下降。黃杰等[17]在進行單因素研究的試驗中發(fā)現(xiàn)，茶多糖的提取得率隨著超聲時間的增加而呈升高趨勢，沒有出現(xiàn)提取得率降低的情況，可能與所處環(huán)境溫度相對比較低有關(guān)。李碧嬋等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在提取過程的開始階段，茶多糖的得率隨著超聲時間的延長而升高，在60 min 之后，隨著浸提時間的增加茶多糖得率反而下降。

本試驗以明后老安吉白茶葉為原料提取茶多糖這一生理活性物質(zhì)，通過響應面試驗優(yōu)化提取工藝，選用ABTS 法檢測茶多糖的抗氧化能力，再利用紅外光譜法檢測茶多糖的結(jié)構(gòu)，研究超聲波輔助提取茶多糖的工藝，使之應用于茶飲等相關(guān)抗氧化產(chǎn)品中，從而提高粗老茶葉的應用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為明后安吉白茶葉，茶葉于60 ℃烘干后，粉碎備用。

1.2 試劑與儀器

分析純2，2′- 聯(lián)氨- 雙-3- 乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸（ABTS）；濃硫酸、蒽酮、過硫酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均為分析純。

UV2550 型紫外- 可見分光光度計（Shimadzu Corporation（Kyoto Japan））；KQ2200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；Centrifuge 5810R 型離心機eppendof（New Brunswick）；京制00000246 號電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；WB-2000 型水浴鍋（杭州庚雨儀器有限公司）；C21-RT2123 型電磁爐（廣東省美的生活電器制造有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖含量的測定 選擇蒽酮- 硫酸比色法[19]對白茶中的多糖含量進行檢測。葡萄糖標準曲線的繪制：準確稱取100 mg 葡萄糖溶解在蒸餾水中，然后將溶液定容至1 000 mL，配制為0.1 mg/mL 的葡萄糖標準液。另準確稱取0.05 g 蒽酮和量取25 mL濃硫酸，在燒杯中緩慢混合均勻，配成蒽酮試劑（在30 min 內(nèi)使用）。準確量取葡萄糖標準液（0.1 mg/mL）0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置于試管中，各加入一定量的蒸餾水使每只試管內(nèi)液體總體積為1.0 mL，稀釋后各溶液的濃度分別為0，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL。再分別往每只試管內(nèi)加入3.0 mL 配制好的蒽酮試劑，將試管內(nèi)液體充分混勻，放置在沸水浴中加熱7 min 使之充分反應，迅速冷卻后于620 nm 處測出每一組的吸光值。以葡萄糖溶液的濃度（C）作為橫坐標、吸光度值（A）作為縱坐標，得到葡萄糖標準曲線：A＝9.147 6C＋0.040 6（R2＝0.991 2）。

1.3.2 茶多糖基本提取工藝流程 白茶→烘干→粉碎→熱水浸提→超聲波輔助浸提→定容至50 mL→離心（7 000 r/min，5 min）→過濾，得上清液→濾液濃縮→加無水乙醇沉淀→離心取沉淀→無水乙醇洗滌→干燥→白茶粗多糖。

1.3.3 茶多糖提取得率的計算 其計算公式如下。

其中，Y 為茶多糖的提取得率（%）；c 為基于葡萄糖標準曲線而計算出的樣品中茶多糖的濃度（mg/mL）；n 為稀釋倍數(shù)；V 為溶液體積（mL）；m 為稱取的白茶質(zhì)量（g）。

1.3.4 單因素試驗 準確稱取0.5 g 白茶粉，90 ℃蒸餾水作為溶劑，研究料液比（1∶20，1∶40，1∶60，1∶80（g/mL））、超聲時間（30，60，90，120 min）和提取次數(shù)（1，2，3，4 次）對茶多糖提取得率的影響。

1.3.5 響應面優(yōu)化試驗 基于單因素試驗結(jié)果，分別以料液比（A）、超聲時間（B）和提取次數(shù)（C）為自變量，將白茶多糖提取得率（Y）作為響應值?；贐ox-Behnken 中心組合試驗原理，設計3 因素3 水平響應面分析試驗。試驗因素及水平如表1 所示。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平

1.3.6 茶多糖抗氧化活性測定 選擇清除ABTS+自由基法檢測白茶多糖的抗氧化能力。

ABTS+儲備液的配制：配制2.45 mmol/L K2S2O8溶液，將ABTS 溶于該K2S2O8溶液中，配制成7 mmol/L ABTS+儲備液。將其在常溫的暗室中靜置12～16 h。該儲備液需在3～4 d 內(nèi)使用有效。

ABTS+測定液的配制：用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 值7.4）緩慢稀釋ABTS+儲備液，并不斷檢測混合液的吸光度，使其在734 nm 波長處達到0.700±0.020。

抗氧化能力測定：精確量取樣品待測液0，10，20，30，40，50 μL，蒸餾水定容至50 μL。再各加入4 mL ABTS+測定液。每只試管均振蕩30 s 后，立即檢測在734 nm 處的吸光度[20]。

1.3.7 茶多糖結(jié)構(gòu)檢測 利用紅外光譜法對白茶粗多糖的結(jié)構(gòu)進行分析。

將提取到的茶多糖研磨粉碎，在真空干燥箱中50 ℃干燥至恒質(zhì)量，自然冷卻，KBr 壓片制樣，在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍進行紅外檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 和OriginPro 8 作圖，運用Design-Expert 8.0 建立響應面模型，優(yōu)化試驗結(jié)果的參數(shù)，作統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 茶多糖得率與料液比的關(guān)系 由圖1 可知，隨著溶劑量的增加，白茶多糖提取得率整體呈先升高后下降的趨勢。料液比在1∶20～1∶60（g/mL）時，提取得率顯著遞增，在1∶60（g/mL）時，提取得率達到最高，此時繼續(xù)增加溶劑量，提取得率出現(xiàn)下降趨勢。

2.1.2 茶多糖得率與超聲時間的關(guān)系 由圖2 可知，茶多糖的提取得率和超聲時間之間存在密切關(guān)系。超聲時間為30～90 min 時，白茶多糖得率隨時間的增加呈升高趨勢，并且在90 min 時得率最高。此時若繼續(xù)延長提取時間，得率反而降低。

2.1.3 茶多糖得率與提取次數(shù)的關(guān)系 由圖3 可知，在一定范圍內(nèi)，茶多糖提取得率受到提取次數(shù)較大的影響，提取次數(shù)越多，茶多糖提取得率越高。提取1 次與2 次相比，提取得率明顯升高，當提取次數(shù)達到3 次時，茶多糖得率達到4.24%，所以，提取次數(shù)的增加可以較為有效地增加茶多糖的提取得率。但是從圖3 可以發(fā)現(xiàn)，當提取次數(shù)繼續(xù)增加，達到3 次或4 次時，提取得率的升高速度逐漸變慢。從實際生產(chǎn)成本考慮，提取次數(shù)每增加一次就會引起人力、物力等生產(chǎn)成本的急劇增加，因此，提取3 次為較優(yōu)水平，可進行下一步優(yōu)化分析。

2.2 響應面工藝的優(yōu)化

2.2.1 響應面試驗方案及方差分析 選用響應面法優(yōu)化提取工藝[21]。3 個自變量分別為料液比（A）、超聲時間（B）和提取次數(shù)（C），響應值為白茶多糖提取得率（Y）。試驗的方案和結(jié)果列于表2。

使用Design-Expert 8.0 軟件，選擇其中的Box-Behnken 選項，對表2 中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得白茶多糖提取得率（Y）與三大自變量——料液比（A）、超聲時間（B）和提取次數(shù)（C）的二元多項回歸方程。統(tǒng)計分析表2 顯示的結(jié)果，可得到因子最終方程如下。

對上述二元回歸方程的分析，具體結(jié)果如表3所示。從表3 可以看出，回歸方程中C 對白茶多糖提取得率的影響極顯著，C2對提取得率影響顯著，其他不顯著，表明相對于料液比跟提取時間，提取次數(shù)（C）對白茶多糖提取得率影響最大。根據(jù)方程各變量系數(shù)的大小可知，3 個因素中對提取得率的影響程度最大的是提取次數(shù)（C），其次是料液比（A）和超聲時間（B）。以白茶多糖提取得率為響應值建立的試驗模型差異顯著（P＝0.022 3），而失擬項P＝0.464 7＞0.05，F(xiàn) 檢驗結(jié)果為不顯著，表明本模型對試驗擬合度較好。二元回歸方程顯著，可以較好確定各單因素與響應值之間的關(guān)系。因此，白茶多糖提取的最佳優(yōu)化工藝可利用該方程進行確定[22]。

表2 響應面分析方案及結(jié)果

表3 回歸方程方差分析

2.2.2 響應面因素分析與優(yōu)化條件 在響應面分析中，響應曲面的陡度反映了響應值提取得率對于提取條件變化的敏感度，響應面存在最高極值點，說明試驗因素的交互作用有最大值[17]。從圖4 可以看出，料液比和超聲時間之間的響應曲面的陡峭度較小，近似圓形的等高線表明交互作用較小。從圖5，6 可以看出，料液比和提取次數(shù)、超聲時間和提取次數(shù)的相互作用的等高線均呈橢圓形，響應曲面的陡峭度較大，說明相互作用較大。比較每2 個因素交互作用的響應面曲張程度可知，超聲時間與提取次數(shù)的交互項的影響相對其他交互項顯著，這與試驗的方差分析結(jié)果一致（表3）。

利用Design-Expert 8.0 軟件，在各因素所選取的范圍內(nèi)進行分析，并結(jié)合實際操作的便捷度進行綜合考慮后，最終確定白茶多糖的最優(yōu)提取工藝為：料液比1∶62（g/mL），超聲時間94 min，提取次數(shù)3 次。此工藝下預測可提取9.7%的茶多糖。用修正后的最佳工藝重復提取3 次以驗證預測結(jié)果，得到平均值為9.5%，與預測值誤差0.2 百分點，說明回歸方程的極值分析結(jié)果較準確，用響應面法優(yōu)化白茶多糖提取工藝具有實際應用價值。

2.3 茶多糖抗氧化能力分析

由圖7 可知，提取液中的茶多糖對ABTS+自由基表現(xiàn)出較強的清除活性，且該能力與茶多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當茶多糖質(zhì)量濃度達到0.09 mg/mL左右時，約99%的ABTS+自由基被清除。

2.4 茶多糖紅外光譜分析

由圖8 可知，在3 270 cm-1處出現(xiàn)一種寬峰，這是糖類物質(zhì)中O-H 的伸縮振動引起的；在2 930 cm-1處出現(xiàn)的是C-H 的伸縮振動區(qū)；在2 000～1 600 cm-1處出現(xiàn)的是C＝O 的伸縮振動區(qū)；在1 050 cm-1處出現(xiàn)的是C-O 形成的伸縮振動區(qū)。

3 結(jié)論與討論

白茶中茶多糖的高效提取對于茶多糖功能的研究具有重要的意義。本試驗研究料液比、超聲時間和提取次數(shù)與茶多糖提取得率之間的相互作用?；趩我蛩卦囼灲Y(jié)果，利用響應面法優(yōu)化提取工藝。綜合考慮提取的有效性和茶多糖的穩(wěn)定性，在研究中超聲時間選取90 min 為較優(yōu)水平。通過響應面分析的方法最終確定最佳提取工藝為：料液比1∶62（g/mL），超聲時間94 min，提取次數(shù)3 次；以此工藝提取茶多糖，得率預測值為9.7%。在最佳條件下重復3 次，最終取均值9.5%，與模型預測值僅相差0.2 百分點?？梢娺x擇響應面試驗優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)在準確度和可靠性上都較高，有較好的實用價值。相較于其他試驗，如劉暢等[23]對安吉白茶多糖提取工藝的優(yōu)化，本研究不但將熱水浸提的溫度從85 ℃提高到了90 ℃還考慮到了提取次數(shù)對于得率的影響，并且在增加提取次數(shù)的情況下成功提高了茶多糖的提取得率。選用清除ABTS+自由基法檢測白茶提取液中茶多糖的抗氧化能力，結(jié)果表明，茶多糖對ABTS+表現(xiàn)出較強的清除能力，并且與茶多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當茶多糖質(zhì)量濃度達到0.09 mg/mL 時，ABTS+清除率可達到99%。