劉瑩，賈俊亞，林珊

(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津300052)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥，是糖尿病患者最常見的死亡原因之一，其臨床特點是持續(xù)性蛋白尿和腎功能進行性下降，最終不可避免地發(fā)展到終末期腎病(ESRD)[1]。Klotho蛋白是一種單次跨膜蛋白，在腎臟和腦高表達，腎臟低表達Klotho蛋白會促進腎臟纖維化，在DN腎小管上皮細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中起重要作用。Klotho蛋白還是自噬信號的重要調(diào)節(jié)者。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)是自噬體膜上的標記蛋白，胞漿中存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式。LC3蛋白在合成后C端就被相關(guān)蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ。當自噬體形成后，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ并保留在自噬體膜上，直到與溶酶體融合，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值可以反映自噬水平的高低[2]。帕立骨化醇是具有生物活性的維生素D類似物，除了對慢性腎臟病患者繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進具有良好的療效外，還具有腎臟保護作用。有研究[3]表明，帕立骨化醇可增加腎小管上皮細胞Klotho表達。Tan等[4]研究發(fā)現(xiàn)，帕立骨化醇能維持梗阻性腎病小鼠的E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、維生素D受體水平，抑制纖連蛋白及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ型mRNA的表達，抑制TGF-β1表達及細胞增殖、凋亡，抑制EMT，減輕腎間質(zhì)纖維化，保護腎小管上皮細胞完整性。2016年1月6日～2016年4月20日，本研究通過鏈脲佐菌素(STZ)誘導制備DN大鼠模型，在此基礎(chǔ)上給予帕立骨化醇腹腔注射治療，觀察大鼠腎臟病理變化及自噬相關(guān)蛋白(Klotho蛋白、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)表達情況，判斷帕立骨化醇對DN大鼠腎損傷的改善作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠、試劑及儀器 清潔級雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量約220 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學實驗動物中心。帕立骨化醇注射液購于意大利Abbott S.P.A公司，STZ購自美國Sigma-Aldrich生物技術(shù)公司，兔抗LC3單抗購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗Klotho多抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，兔抗E-cadherin多抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。血糖儀、血糖試紙購自上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司。

1.2 大鼠分組、DN模型制備、帕立骨化醇腹腔注射方法及標本留取 18只雄性SD大鼠隨機分為對照組(A組)、DN組(B組)、DN+帕立骨化醇組(C組)，每組6只。參照文獻[5]方法，B、C組大鼠采用一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg的方法制作DN模型，72 h后測空腹血糖(FPG)，F(xiàn)PG>16.7 mmoL/L認定DN模型制備成功。DN模型制備成功后，C組大鼠每周3次腹腔注射低劑量帕立骨化醇0.4 μg/kg，A、B組同期腹腔注射等量生理鹽水。各組大鼠腹腔注射12周后，取內(nèi)眥靜脈血，放入代謝籠中禁食水并收集24 h尿液，然后處死大鼠，取大鼠腎臟組織分離腎皮質(zhì)備檢。

1.3 各組大鼠體質(zhì)量、血肌酐(Scr)、FPG、尿蛋白測算 第12周末稱量各組大鼠體質(zhì)量；取內(nèi)眥靜脈血，采用苦味酸法檢測大鼠Scr，采用快速血糖儀檢測FPG；取收集的24 h尿液，采用比濁法測定尿蛋白。

1.4 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學檢查 采用六胺銀(PASM)染色法。取大鼠腎臟組織分離腎皮質(zhì)，固定、石蠟包埋、切片，PASM染色后，顯微鏡下觀察。

1.5 各組大鼠腎小管間質(zhì)E-cadherin檢測 采用免疫組織化學法。取各組4 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2阻斷，1% Triton X-100處理5 min，2% BSA封閉30 min，微波修復；滴加適當濃度稀釋的一抗4 ℃過夜，加入HRP標記相應二抗37 ℃ 20 min，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。在顯微鏡下觀察并拍攝照片保存，每張切片隨機選取照片10副，采用Image ProPlus 6.0軟件測量照片中陽性反應部位的累計光密度值(IOD)，以IOD值表示大鼠腎小管間質(zhì)E-cadherin的表達相對表達量。

1.6 各組大鼠腎組織自噬相關(guān)蛋白檢測

1.6.1 各組大鼠腎小管上皮細胞Klotho蛋白檢測 采用免疫熒光法。取各組4 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復，然后漂洗；2% BSA 37 ℃濕盒內(nèi)封閉30 min，分別加1∶100稀釋的Klotho 4 ℃孵育過夜；漂洗后加熒光標記的二抗抗體37 ℃濕盒中避光作用30 min；漂洗后甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察各組標本熒光強度，并進行半定量分析：無熒光(-)記為0，極弱的可疑熒光(±)記為0.5，熒光較弱但清楚可見(+)記為1，熒光明亮(++)記為2，熒光閃亮(+++～++++)記3～4。

1.6.2 各組大鼠腎皮質(zhì)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ檢測 采用Western blotting法。RIPA緩沖液裂解凍存腎組織提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，加一抗4 ℃過夜，TBST緩沖液洗膜3次，二抗孵育2 h后洗膜3次，增強化學發(fā)光，以β-Actin為內(nèi)參，采用FluorChem凝膠成像儀掃描成像，AlphaView軟件定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、Scr、FPG、尿蛋白比較 如表1所示，與A組相比，B、C組大鼠體質(zhì)量降低，Scr、FPG及尿蛋白水平均顯著升高(P均<0.05)；與B組相比，C組大鼠Scr及尿蛋白水平均顯著降低(P均<0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、Scr、FPG、尿蛋白比較

注：與A組相比，aP<0.05；與B組相比，bP<0.05。

2.2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學變化 A組腎小球及腎小管間質(zhì)無明顯病理改變；B組腎小球體積增大，系膜細胞基質(zhì)增多，腎小管細胞肥大，出現(xiàn)泡沫樣變、小灶性萎縮、輕度炎性細胞浸潤；C組腎小管及腎小管間質(zhì)損害較B組明顯減輕，腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化不明顯，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)(PASM染色，400×)

2.3 各組大鼠腎小管間質(zhì)E-cadherin比較 A、B、C組大鼠腎小管間質(zhì)E-cadherin相對表達量分別為222±37、139±19、192±38，組間相比，P均<0.05。

2.4 各組大鼠腎組織自噬相關(guān)蛋白檢測結(jié)果比較

2.4.1 各組大鼠腎小管上皮細胞Klotho蛋白比較 A、B、C組大鼠腎小管上皮細胞Klotho蛋白熒光強度分別為3.5±0.3、1.5±0.3、2.8±0.6，組間相比，P均<0.05。

2.4.2 各組大鼠腎皮質(zhì)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較 A、B、C組大鼠腎皮質(zhì)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ分別為1.5±0.2、1.0±0.2、2.8±0.6，組間相比，P均<0.05。

3 討論

帕立骨化醇生物學活性與活性維生素D3相似，不僅能降低腎病患者尿蛋白水平，也能抑制腎成纖維細胞的增殖和轉(zhuǎn)化，減輕腎間質(zhì)纖維化[6]。Zhang等[7]研究顯示，STZ誘導DN小鼠單用帕立骨化醇治療，可通過抑制腎素轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮腎臟保護作用，使用帕立骨化醇與氯沙坦聯(lián)合治療，完全避免了蛋白尿的發(fā)生，還能修復腎小球濾過屏障，減輕腎小球硬化。也有研究[3]表明，帕立骨化醇可增加腎小管上皮細胞Klotho蛋白的表達。

本研究中血尿生化指標檢測結(jié)果表明，DN大鼠Scr、FPG、尿蛋白水平顯著升高，體質(zhì)量明顯減輕，經(jīng)過帕立骨化醇腹腔注射治療后，C組大鼠Scr、尿蛋白水平顯著降低，但體質(zhì)量較B組無明顯改變；結(jié)合PASM染色結(jié)果，B組大鼠DN病理改變明顯，而C組腎小管及間質(zhì)損害較B組減輕，這說明帕立骨化醇可抑制DN腎小管EMT，減輕蛋白尿，改善腎功能。

EMT參與器官、組織的再生及纖維化過程，還可以在惡性腫瘤不受控制的生長中見到。腎臟纖維化最終可導致腎臟功能受損甚至發(fā)展為ESRD，其特征包括腎小管上皮向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化即EMT[8]。人類腎臟纖維化中可見EMT，并且隨著疾病的進展，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子逐漸增強[9]。上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細胞的重要原因就是E-cadherin丟失[10]。E-cadherin在各種組織中表達，并參與依賴Ca2+的細胞與細胞之間的互相黏附、連接[11,12]。本研究中，B組E-cadherin表達較A組顯著下降，但C組較B組明顯升高，說明DN可通過調(diào)節(jié)E-cadherin的表達導致上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細胞，進而導致了腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化，而帕立骨化醇可緩解這一過程。

Klotho蛋白在腎臟和腦部表達最多，可通過多種形式發(fā)揮生物學功能，在抗老化、抗氧化、抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)Wnt信號傳導及腎臟離子通道等多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用[13,14]。錢盈盈等[15]研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注急性腎損傷后小鼠腎組織Klotho蛋白表達顯著下調(diào)，Klotho蛋白水平的下調(diào)可能與凋亡誘導的腎損害密切相關(guān)。在本研究中，B、C組Klotho蛋白表達均下降，但與B組相比，C組Klotho表達升高，說明DN可導致Klotho蛋白表達的下降，我們認為DN通過Klotho自噬信號降低了腎小管上皮細胞的自噬作用，進而導致了EMT的發(fā)生；而帕立骨化醇可通過抑制DN大鼠Klotho蛋白的表達下降，進而增強腎小管上皮細胞的自噬作用，從而達到預防DN大鼠腎間質(zhì)EMT的目的。

自噬是溶酶體參與的降解細胞成分的一種途徑，是細胞內(nèi)維持自身穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機制[16,17]。隨著人們對自噬的廣泛研究，自噬在腎臟疾病中的作用逐漸引起關(guān)注。有學者報道[18]，DN動物模型甚至DN患者中發(fā)生腎小管上皮細胞自噬障礙，導致本該經(jīng)自噬溶酶體途徑降解的受損細胞器和胞漿成分等在細胞內(nèi)累積，可能是加劇腎小管間質(zhì)的損傷、細胞外基質(zhì)增多的重要原因。Kitada等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在DN大鼠腎組織中，近端腎小管細胞自噬受到抑制。本研究中，B組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較A組明顯降低，C組較B組升高，提示DN狀態(tài)下腎小管自噬減低，而帕立骨化醇可上調(diào)自噬水平。

綜上所述，帕立骨化醇能上調(diào)腎小管上皮細胞Klotho-自噬信號活性，進而增強DN大鼠腎小管上皮細胞內(nèi)自噬作用，從而抑制腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，減輕蛋白尿，改善腎功能，延緩腎衰竭進展。