南泥灣野生山丹丹組培快繁技術(shù)

王凱 王凱琪 常裕

摘要：為建立南泥灣野生山丹丹快繁和植株再生系統(tǒng)，并進(jìn)一步為山丹丹試管內(nèi)育種提供材料，以南泥灣林場后場采集到的野生山丹丹的鱗莖為材料，研究不同濃度6-BA對南泥灣野生山丹丹啟動培養(yǎng)的影響、不同6-BA與IBA濃度組合對其繼代培養(yǎng)的影響、IBA濃度對其組培苗生根的影響，并對生根苗進(jìn)行了煉苗移栽。結(jié)果表明，（1）南泥灣野生山丹丹啟動培養(yǎng)的較佳培養(yǎng)基為MS+白砂糖30 g/L+瓊脂5.5 g/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L+活性炭 0.2 g/L，9 d轉(zhuǎn)綠，21 d分化出了小鱗莖，分化率為84%;（2）較佳繼代培養(yǎng)基為MS+白砂糖30 g/L+瓊脂 5.5 g/L+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，培養(yǎng)25 d后，繁殖率（繁殖系數(shù)）為7.3;（3）較佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+白砂糖30 g/L+瓊脂5.5 g/L+IBA 0.3 mg/L，培養(yǎng)25 d后，生根率為84%，以上培養(yǎng)基pH值均為6.8。用生根培養(yǎng)的山丹丹組培苗煉苗移栽成活率達(dá)到了100%。

關(guān)鍵詞：野生山丹丹;鱗莖;組織培養(yǎng);植株再生;6-BA

中圖分類號： S682.2+90.4+3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0059-03

山丹丹，學(xué)名山丹（Lilium pumilum DC.），為百合科百合屬多年生球根花卉。山丹丹鱗莖含淀粉，供食用，也可入藥，有滋補強壯、止咳祛痰、利尿等功效?；r紅色，下垂。山丹丹是一種抗寒性很強的優(yōu)良的百合屬種質(zhì)資源，可用于培育抗寒耐旱的百合花品種[1-2]。南泥灣野生山丹丹（圖1）種質(zhì)是延安大學(xué)山丹丹大學(xué)生創(chuàng)業(yè)團隊2013—2015年在南泥灣林場進(jìn)行種質(zhì)資源調(diào)查時發(fā)現(xiàn)的。南泥灣野生山丹丹種質(zhì)相較于勞山種質(zhì)有花色為橙紅色、上仰的特異性。山丹丹在自然狀態(tài)下繁殖系數(shù)小，人們對其保護意識不強、過度采挖以及生態(tài)環(huán)境的變化，導(dǎo)致野生山丹品質(zhì)退化嚴(yán)重、數(shù)量稀少。

組織培養(yǎng)技術(shù)可以有效提高山丹丹繁殖效率、改善品質(zhì)退化等。目前，已經(jīng)建立山丹丹離體快繁再生體系，并對山丹丹組培苗的繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及移栽條件進(jìn)行研究[3-5]。陜北地區(qū)山丹丹組培快繁研究僅有勞山山區(qū)的種質(zhì)[6]，南泥灣種質(zhì)并無報道。我們采用組培快繁的方法對南泥灣野生山丹丹進(jìn)行快速大量繁殖，以期建立南泥灣野生山丹丹快繁和植株再生系統(tǒng)，解決該種質(zhì)數(shù)量稀少的問題，并進(jìn)一步為山丹丹試管內(nèi)育種提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為2015年5月采自陜西省延安市寶塔區(qū)南泥灣林場后場的8顆野生山丹丹鱗莖。

1.2 方法

1.2.1 啟動培養(yǎng) 將鱗莖外層腐爛鱗片剝除，鱗盤朝上用自來水沖洗2 min，用吸水紙吸干表面水分，放入超凈工作臺備用。再將啟動培養(yǎng)基、接種工具、0.1% HgCl2、吐溫20以及75%無水乙醇放入超凈工作臺備用，打開紫外燈和空氣快速殺菌消毒機（型號：LH-2000）滅菌30 min之后，在超凈工作臺上將鱗片剝下，用75%無水乙醇將鱗片浸泡30 s，無菌水清洗1 min。轉(zhuǎn)入0.1% HgCl2加1滴吐溫20，振蕩8 min，無菌水清洗3次，每次2 min，再用無菌濾紙吸干表面水分后的鱗片接種于啟動培養(yǎng)基上。每瓶接種1個鱗片，每個激素水平接種13瓶。先散光培養(yǎng)7 d，防止其失水褐化，后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度設(shè)置在（25±2） ℃，光照時間12 h/d，光照度（1 500±200） lx，相對濕度60%～75%。

啟動培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+白砂糖30 g/L+瓊脂5.5 g/L，pH值為6.8。6-BA濃度為0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L共4個水平，并加入NAA 0.01 mg/L和活性炭2 mg/L。

1.2.2 繼代培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)出的小鱗莖，待其芽苗生長、抽出肥綠葉片之后，接入繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶接入1個小鱗莖，每處理接10瓶，以30 d為1個培養(yǎng)周期。培養(yǎng)溫度（24±2） ℃，光照時間12 h/d，光照度（1 500±200） lx，相對濕度60%～75%。

繼代培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+白砂糖30 g/L+瓊脂5.5 g/L，pH值為6.8。使用6-BA濃度0.8、1.0、1.2、1.4 mg/L 共4個水平，IBA濃度0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L共4個水平的2因素4水平試驗。

1.2.3 生根培養(yǎng) 挑選生長健壯、無污染的繼代苗轉(zhuǎn)接進(jìn)生根培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基：1/2 MS+白砂糖30 g/L+瓊脂5.5 g/L，pH值為6.8，IBA濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L共4個水平。培養(yǎng)溫度 （24±2） ℃，光照時間12 h/d，光照度（1 500±200） lx，相對濕度60%～75%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度6-BA對山丹丹啟動培養(yǎng)的影響

接種后4個濃度處理的污染率分別為0%、7%、0%、7%（表1），均可滿足試驗需求。鱗片在啟動培養(yǎng)基上9 d左右呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)綠情況，14 d左右邊緣呈現(xiàn)白色顆粒狀突起，21 d左右突起的部分分化出小鱗莖（圖2），隨后不斷長出葉片。每個鱗片上分化出了4～8個小鱗莖。啟動培養(yǎng)中統(tǒng)計結(jié)果（表1）表明，不同濃度6-BA的培養(yǎng)基中，鱗片的分化情況不同，總體為先升高后降低。轉(zhuǎn)綠率，6-BA濃度為 1.0 mg/L 時最高，1.5 mg/L時次之，0.1 mg/L 時最低。出芽率，當(dāng)6-BA在1.0 mg/L濃度時最高，1.5 mg/L濃度時次之，0.1 mg/L時最低。所以認(rèn)為在 6-BA濃度為1.0 mg/L時對南泥灣地區(qū)山丹丹啟動培養(yǎng)效果好。

2.2 6-BA與IBA對山丹丹繼代培養(yǎng)的影響

2.2.1 6-BA與IBA組合對繼代培養(yǎng)的影響 繼代培養(yǎng) 15 d 左右材料均分化出含有鱗片的葉（圖3），25 d時統(tǒng)計新生出芽數(shù)（以2葉片中間所夾的生長點為準(zhǔn)），增殖系數(shù)見表2，不同處理下增殖系數(shù)呈現(xiàn)出不同的變化。F6處理下新生芽數(shù)最多，為73個，增殖系數(shù)達(dá)到最大，為7.3。其次為F7處理，新生芽有69個，增殖系數(shù)為6.90。再其次為F5處理，新生芽有52個，增殖系數(shù)為5.2。最差的是F1處理，只分化出3個新芽，增殖系數(shù)也只有0.30?？梢奆6處理下即6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L的6-BA與IBA組合較其他組合更有利于南泥灣地區(qū)山丹丹組培的繼代培養(yǎng)。

2.2.2 6-BA與IBA各自對繼代培養(yǎng)的影響 在不同培養(yǎng)基中，隨著6-BA濃度的增大，增值系數(shù)先增加后減小，在 6-BA 濃度為 1.0 mg/L 時達(dá)到最大值， 為 5.70。 隨著IBA的濃度增大，增值系數(shù)在0.2 mg/L時達(dá)到最大，為2.90。這2種外源激素對繼代培養(yǎng)的方差分析結(jié)果見表3，6-BA的F值為23.92，大于臨界值F0.05，所以6-BA的影響達(dá)到顯著水平;IBA的F值為0.18，未達(dá)顯著水平。

2.3 IBA濃度對山丹丹組培苗生根的影響

將繼代培養(yǎng)獲得的組培苗接種在IBA濃度不同的生根培養(yǎng)基上，10 d觀察到山丹丹鱗片基部有乳白色顆粒狀的愈傷組織形成，然后分化出根（圖4）。25 d后統(tǒng)計結(jié)果見表4，顯示所有IBA濃度下都有根生成，且IBA濃度對生根率、根長、生根條數(shù)和根的形態(tài)有影響。在IBA濃度為 0.3 mg/L 的水平下生根率達(dá)到最高，為84%，平均根長達(dá)到3.22 cm，平均根數(shù)5.3條，均優(yōu)于其他3個水平;根的形態(tài)為基部膨大、端部細(xì)長。

3 煉苗移栽

3.1 煉苗

用高錳酸鉀溶液對栽培工具浸泡消毒。將生根培養(yǎng)獲得的組培苗挑選長出5～7張葉子、葉片最低高度達(dá)5 cm、生根數(shù)達(dá)5條以上、根長達(dá)到4 cm以上的生根苗進(jìn)行煉苗。先將生根苗連同培養(yǎng)瓶一起置于移栽設(shè)施中放置7 d，然后打開瓶口再放置2～3 d。

3.2 移栽

將煉苗后成活的生根苗取出，清洗掉多余的培養(yǎng)基，定植在營養(yǎng)缽內(nèi)，每個營養(yǎng)缽裝栽培基質(zhì)100 g，栽種1株生根試管苗（圖5）。移栽后每7 d澆1/2MS大量營養(yǎng)液1次。空氣濕度保持在80%～90%，遮光率50%，光照度（1 000±500） lx ，環(huán)境溫度控制在22～26 ℃。移栽過程每天觀察植株的生長情況，在小苗管理期間要經(jīng)常噴水，防止?fàn)€根。每隔2～3周追1次稀薄液體肥料，定期噴灑殺菌劑，預(yù)防病害發(fā)生。經(jīng)2個月的管理，待小苗長出5對以上新葉后即為移栽成活。調(diào)查結(jié)果表明，成活率為100%。

4 討論與結(jié)論

啟動培養(yǎng)是否成功與外植體選擇有很大關(guān)系。馬永紅等認(rèn)為，以山丹丹器官作為外植體時分化能力由大到小為種子>鱗片>幼嫩莖段>葉片[7]。鑒于鱗片誘導(dǎo)不受季節(jié)因素影響，本次試驗選用南泥灣野生山丹丹鱗片進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)芽率達(dá)84%。鱗片易于誘導(dǎo)、繁殖系數(shù)高，但其后期污染率較高，要及時轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基。劉冬云等篩選適合山丹丹的啟動培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L[8-9]。本試驗篩選的啟動培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L，其中差異可能由材料的生態(tài)類型引起，還有待進(jìn)一步研究。影響山丹丹生長發(fā)育的重要因素之一是植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度。van Aartrijk等認(rèn)為，低濃度生長素和高濃度細(xì)胞分裂素的組合對百合鱗片分化有促進(jìn)作用[10]。本試驗篩選出有利于南泥灣山丹丹繼代培養(yǎng)的外源激素濃度為1.0 mg/L 6-BA與濃度為0.2 mg/L的IBA組合，驗證了該結(jié)論。本試驗繼代培養(yǎng)中，對不定芽的增殖有決定性作用的是細(xì)胞分裂素，而生長素對不定芽葉片的生長分化有至關(guān)重要的影響。高濃度6-BA、低濃度IBA的培養(yǎng)基易于分化不定芽，而在一定的IBA濃度范圍內(nèi)，增殖的芽數(shù)隨著6-BA濃度的提高而增長，但芽之間變得越發(fā)緊湊，適當(dāng)增加IBA的濃度，不定芽葉片伸張，鱗莖也有所膨大。誘導(dǎo)生根一般需要降低無機鹽濃度，常使用低濃度的MS培養(yǎng)基[11]，本次使用1/2MS誘導(dǎo)出了根，但生根培養(yǎng)基中IBA濃度不宜過高，否則會產(chǎn)生愈傷組織，再在愈傷組織下面生出根，這樣的根容易掉落，不利于移栽。

以南泥灣野生山丹丹的鱗莖進(jìn)行組培快繁得出以下結(jié)論：較佳啟動培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L+AC 2 mg/L，此時出芽率達(dá)到84%;較佳繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，增殖系數(shù)達(dá)到7.3;較佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.3 mg/L，生根率為84%。以上培養(yǎng)基均附加白砂糖30 g/L、瓊脂5.5 g/L，pH值均為6.8。用繼代培養(yǎng)的山丹丹組培苗煉苗移栽成活率達(dá)到100%。

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