浙江省泰順縣獼猴桃周年病害調(diào)查及病原菌鑒定

潘慧 鄧?yán)? 陳美艷

摘要：浙江省泰順縣周年雨水較多，部分獼猴桃園區(qū)由于栽培管理方式不當(dāng)造成病害嚴(yán)重流行。中國(guó)科學(xué)院武漢植物園聯(lián)合泰順縣林業(yè)局分別于2016年8月、10月，2017年4月對(duì)泰順縣7個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)共19個(gè)代表性栽培果園進(jìn)行了獼猴桃周年病害調(diào)查。通過(guò)采集大量典型病害樣本，結(jié)合生物學(xué)特征、分子鑒定及致病性驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，泰順縣獼猴桃夏季和秋冬季主要病害為細(xì)菌性潰瘍病和真菌性軟腐病、黑斑病、灰斑病和炭疽病;春季潰瘍病發(fā)生率顯著升高，但真菌病害輕微很多。調(diào)查結(jié)果可為泰順縣后期獼猴桃病害的預(yù)測(cè)及綜合防治提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：獼猴桃;病害;生物學(xué)特征;ITS鑒定;Psa鑒定

中圖分類號(hào)： S436.634 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0104-07

獼猴桃（Actinidia spp.）隸屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia Lindl.），具有很高的營(yíng)養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前在中國(guó)、新西蘭、意大利、法國(guó)、智利等國(guó)家廣泛種植[1]。浙江省泰順縣地處溫州西南，是我國(guó)浙江省第二大獼猴桃主產(chǎn)區(qū)，至2017年12月全縣發(fā)展獼猴桃近930 hm2，年產(chǎn)量約 9 000 t。目前主要在羅陽(yáng)鎮(zhèn)、泗溪鎮(zhèn)、三魁鎮(zhèn)、司前鎮(zhèn)、筱村鎮(zhèn)、百丈鎮(zhèn)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)種植，品種多數(shù)為紅陽(yáng)，其次是布魯諾和華特，近幾年開始逐步發(fā)展金艷和Hort16A等品種。

浙江省泰順縣屬于亞熱帶海洋型季風(fēng)氣候，雨量充沛，氣候溫和濕潤(rùn)，土壤為山區(qū)沙質(zhì)壤土，優(yōu)越的地理環(huán)境為獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了保障。但同時(shí)獼猴桃生長(zhǎng)季節(jié)雨水也較多，部分果農(nóng)栽培管理方式不當(dāng)，導(dǎo)致園區(qū)陰蔽潮濕，造成獼猴桃細(xì)菌性及真菌性病害的流行，阻礙了當(dāng)?shù)孬J猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，中國(guó)科學(xué)院武漢植物園聯(lián)合泰順縣林業(yè)局于2016年8月、10月，2017年4月對(duì)該縣7個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)19個(gè)代表性栽培園區(qū)進(jìn)行了獼猴桃周年病害調(diào)查，通過(guò)采樣分析和病原鑒定，全面了解該縣不同季節(jié)獼猴桃病害的種類、危害程度及分布，為后期獼猴桃病害的預(yù)測(cè)及綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 感病樣本采集

2016年8月、10月，2017年4月對(duì)19個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行感病樣本的采集。共采集243份具有明顯病斑的葉片，53份果實(shí)，25份枝干作為試驗(yàn)材料。各采樣點(diǎn)具體地理位置及所采樣本品種見表1。

1.2 病原菌的分離和培養(yǎng)

1.2.1 細(xì)菌性病原菌的分離和培養(yǎng) 葉片樣本用1 cm規(guī)格打孔器取病健交界處3片直徑1 cm的組織，經(jīng)75%乙醇表面消毒，置于裝有600 μL 10 mmol/L MgSO4和2粒鋼珠的 1.5 mL 離心管中，用研磨儀進(jìn)行勻漿。對(duì)于枝干樣本，用無(wú)菌手術(shù)刀切取病健交界處內(nèi)部組織，同樣方法消毒并研磨。將菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，取150 μL 10-3菌懸液涂布于假單胞菌專用固體培養(yǎng)基KB CFC，28 ℃培養(yǎng)2 d后劃線分離單菌落。挑取生物學(xué)特征近似丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）的單菌落進(jìn)行氧化酶測(cè)試，保存陰性菌落。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 真菌性病原菌的分離和培養(yǎng) 葉片樣本用1 cm規(guī)格打孔器取病健交界處3片直徑1 cm的組織，經(jīng)75%乙醇表面消毒后置于PDA培養(yǎng)基25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。針對(duì)果實(shí)樣本，運(yùn)用無(wú)菌手術(shù)刀切取病健交界處果肉組織直接置于PDA培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)5 d。待平板長(zhǎng)出菌落后，選取菌絲尖端置于新PDA平板以獲得純菌株。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 病原菌的分子鑒定

1.3.1 細(xì)菌性潰瘍病病原菌分子鑒定 運(yùn)用Rees等的方法[2]，用特異引物PsaF1（5′-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3′）和PsaR2（5′-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3′）;擴(kuò)增反應(yīng)體系 10 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，含Mg2+的10×PCR buffer 1 μL，100 μmol/L 引物各0.1 μL，5 U/μL Taq酶 0.1 μL，1.1 g/mL 二甲基亞砜（DMSO） 0.2 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 6.3 μL;PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否有潰瘍病菌菌株可擴(kuò)增得到的大小為280 bp的目的條帶。

1.3.2 真菌ITS鑒定 將純菌株置于平鋪玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃靜置培養(yǎng)5～8 d后收集菌絲。采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，置于-20 ℃?zhèn)溆?。運(yùn)用真菌核糖體基因組轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS4/ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增（ITS5序列，GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG;ITS4序列，TCCTCCGCTTATTGATATGC）。擴(kuò)增反應(yīng)體系40 μL，10 mmol/L dNTP 0.80 μL，含Mg2+的10×PCR buffer 4.00 μL，100 μmol/L引物各0.20 μL，5 U/μL Taq酶 0.25 μL，1.10 g/mL DMSO 0.80 μL，DNA模板2.00 μL，ddH2O 31.75 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.5% 瓊脂糖凝膠檢測(cè)后送至華大基因公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，作同源性相似度差異性分析，確定菌株的分類地位。

1.4 致病性驗(yàn)證

1.4.1 細(xì)菌性病原菌致病性驗(yàn)證 將單菌落置于液體KB培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)3～4 d，轉(zhuǎn)速為180 r/min。將菌懸液稀釋為D600 nm=0.2，噴霧接種20 μL于組培苗葉片上，塑料蓋密封保濕48 h，同時(shí)接種無(wú)菌水為陰性對(duì)照，5～6 d 后觀察發(fā)病情況。接種試驗(yàn)重復(fù)3次。待葉片發(fā)病后從病健交界處再次分離培養(yǎng)菌落，進(jìn)行氧化酶測(cè)試和分子鑒定。

1.4.2 真菌性病原菌致病性驗(yàn)證 將果實(shí)和葉片的表面用2號(hào)解剖針刺傷，果實(shí)刺傷深度為2～3 mm，將5 mm無(wú)菌打孔器制成的菌株菌餅接種于傷口處，菌絲面朝下并覆蓋無(wú)菌濕棉球，置于透明盒中密封保濕，同時(shí)以接種PDA瓊脂塊為對(duì)照，5～8 d后觀察發(fā)病情況。每個(gè)菌株的接種試驗(yàn)重復(fù)3次。果實(shí)和葉片發(fā)病后從病健交界處再次分離培養(yǎng)病原菌，與原接種菌株進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病癥狀

在浙江省泰順縣大部分栽培園區(qū)觀察到疑似灰斑病、黑斑病、炭疽病、潰瘍病和果實(shí)軟腐病的的癥狀（圖1），感病癥狀與羅祿怡等描述的[3-7]一致。疑似灰斑病感病癥狀：葉面病斑呈灰褐至暗褐色，葉背黑褐色。疑似黑斑病感病癥狀：葉背黑色霉?fàn)畈“?，病部?duì)應(yīng)的葉面出現(xiàn)黃色褪綠斑。疑似炭疽病感病癥狀：葉面病斑中間為灰白色，邊緣深褐色，葉緣略向葉背卷縮。疑似潰瘍病感病癥狀：葉面有不規(guī)則形褐色斑點(diǎn)，病斑周圍伴有3～5 mm明顯的黃色暈圈;枝干上乳白色黏質(zhì)菌膿與植物傷流混合后呈銹紅色，順著枝干流下。疑似軟腐病感病癥狀：剝開發(fā)病部位表皮，病部中心果肉呈乳白色，周圍呈黃綠色水漬狀。

2.2 細(xì)菌性潰瘍病病原菌的鑒定結(jié)果

經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)，夏季采樣點(diǎn)1的葉片樣本攜帶潰瘍病病原菌，秋冬季采樣點(diǎn)8和14的葉片樣本攜帶潰瘍病病原菌，春季發(fā)現(xiàn)攜帶潰瘍病病原菌采樣點(diǎn)明顯增多，包括采樣點(diǎn)4、9、10、14、15、18、19（圖2）。

2.3 真菌性病原菌的鑒定結(jié)果及預(yù)測(cè)病害

不同季節(jié)采樣鑒定到的全部真菌菌株列表及預(yù)測(cè)病害見表2。部分菌株菌落及其孢子形態(tài)見圖3。小孢擬盤多毛孢菌分生孢子紡錘形或棍棒狀，隔膜分成5個(gè)細(xì)胞，大小為（18.5～22.5） μm×（5.6～7.3） μm;頂孢上著生2～3根長(zhǎng)9.2～20.5 μm的無(wú)色附屬絲。膠孢炭疽菌分生孢子透明圓柱狀，單胞，大小為（9.8～14.3） μm×（4.2～5.4） μm。稻黑孢菌和球黑孢菌分生孢子均為黑色圓球形，單胞，大小直徑分別為10.8～14.3 μm和12.5～18.0 μm。

2.4 致病性驗(yàn)證

致病力試驗(yàn)測(cè)試（圖4）表明，接種細(xì)菌性病原菌的葉片6 d后出現(xiàn)潰瘍病癥狀;接種真菌菌株的刺傷葉片在6 d左右出現(xiàn)癥狀，果實(shí)刺傷處出現(xiàn)典型軟腐癥狀，葉片和果實(shí)的發(fā)病部位也重新分離到原接種菌株，符合柯赫氏法則致病性驗(yàn)證。結(jié)果顯示Psa菌株會(huì)導(dǎo)致獼猴桃潰瘍病;擬盤多毛孢菌可引

起灰斑病;膠孢炭疽菌會(huì)引起炭疽病;球黑孢菌會(huì)導(dǎo)致葉斑病。鏈格孢菌、葡萄座腔菌、間座殼菌、擬盤多毛孢菌均可導(dǎo)致果實(shí)軟腐病;鑒定為其他病原菌的菌株致病力效果并不十分明顯，還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

3 討論與結(jié)論

浙江省泰順縣獼猴桃產(chǎn)業(yè)主要是專業(yè)合作社性質(zhì)，大部分為家庭式種植，栽培范圍從海拔100 m以上至800 m以上，各園區(qū)普遍存在同時(shí)種植早熟、中熟和晚熟多品種的現(xiàn)象，加大了栽培管理難度，從而誘發(fā)獼猴桃病害的流行。本次周年病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，泰順縣獼猴桃夏季和秋冬季主要病害為細(xì)菌性潰瘍病和真菌性軟腐病、黑斑病、灰斑病和炭疽病;春季潰瘍病發(fā)生率顯著升高，但真菌病害輕微很多。

獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種引起，致病性強(qiáng)，病原菌可隨風(fēng)雨進(jìn)行傳播，根除難度較大，目前已成為全球獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素。從泰順縣獼猴桃病害的周年檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，采樣點(diǎn)1、4、8、9、10、14、15、18、19已感染細(xì)菌性潰瘍病，特別是春季潰瘍病的整體發(fā)病率較上一年夏季和秋冬季明顯升高，除采樣點(diǎn)5以外，其他果園都有發(fā)生，品種從紅陽(yáng)擴(kuò)展到米良1號(hào)、華特和翠玉等。其原因主要有3點(diǎn)：（1）主栽品種紅陽(yáng)潰瘍病抗性較差，且泰順地區(qū)2016年冬季低溫、2017年早春倒春寒及花期多陰雨，導(dǎo)致潰瘍病流行蔓延;（2）部分種植戶從網(wǎng)上購(gòu)買獼猴桃接穗苗木、外地隨意引進(jìn)接穗，極有可能攜帶潰瘍病病原菌;（3）當(dāng)?shù)馗鲌@區(qū)種植戶對(duì)潰瘍病認(rèn)識(shí)不足，修剪嫁接前工具未經(jīng)消毒，且經(jīng)常在無(wú)防護(hù)措施的情況下相互參觀潰瘍病疫區(qū)果園，進(jìn)一步加快了潰瘍病的傳播。

真菌性病害方面，目前國(guó)內(nèi)外專家已確定導(dǎo)致獼猴桃果實(shí)軟腐病致病菌有葡萄座腔菌，擬盤多毛孢菌，間座殼菌（擬莖點(diǎn)霉菌的有性態(tài)），鏈格孢菌等[8-14]。同時(shí)，擬盤多毛孢菌和膠孢炭疽菌分別會(huì)引起灰斑病[15]和炭疽病[16]，球黑孢菌引起獼猴桃葉斑病[17]，稻黑孢菌證實(shí)引起黑斑病和褐斑病[18]。此次調(diào)查結(jié)果，夏季和秋冬季果園均鑒定出大量導(dǎo)致獼猴桃果實(shí)軟腐病、黑斑病、炭疽病、灰斑病的病原菌，春季在大部分園區(qū)并未鑒定到真菌性病害病原菌，比夏季和秋冬季輕微很多。另外，部分分離到的真菌病原菌菌株在致病性驗(yàn)證中，尚未發(fā)現(xiàn)引起葉片或果實(shí)明顯的感病癥狀，仍需后期進(jìn)一步驗(yàn)證。泰順縣真菌病害嚴(yán)重，主要原因?yàn)椋?）該縣氣候溫和，雨量充沛，獼猴桃的生長(zhǎng)季雨水較多，且大部分排水溝排水不暢，園區(qū)雨后嚴(yán)重積水導(dǎo)致獼猴桃植株根系腐爛，樹勢(shì)較弱;（2）架式不規(guī)范，泰順縣僅有少數(shù)新果園采用了鋼絲、鋼纜搭架，大部分園區(qū)仍采用傳統(tǒng)的毛竹為支柱，毛竹中易潛藏病原菌，導(dǎo)致病害發(fā)生;（3）大部分果園雜草叢生，通風(fēng)透光極差，易造成病害的流行。

目前，對(duì)于獼猴桃病害的防治措施主要為農(nóng)業(yè)防治與化學(xué)防治相結(jié)合，其中防治關(guān)鍵是加強(qiáng)栽培管理，增強(qiáng)樹勢(shì)，落實(shí)冬季清園和用藥，減少病情基數(shù)。根據(jù)果農(nóng)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)反饋，化學(xué)防治主要為花前施用加瑞農(nóng)、可殺得3 000和異菌脲等藥劑，花后施用嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑等藥劑。針對(duì)細(xì)菌性潰瘍病，防治關(guān)鍵是秋冬季9—12月施用3～4次氫氧化銅、硫酸鏈霉素等進(jìn)行預(yù)防保護(hù)[19-20]。筆者建議當(dāng)?shù)刎?fù)責(zé)部門除重視農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治外，應(yīng)加強(qiáng)種植戶消毒防范意識(shí)以減少人為傳播的發(fā)生，同時(shí)在高海拔地區(qū)種植抗性較好的品種，種苗從當(dāng)?shù)卣?guī)產(chǎn)業(yè)部門引進(jìn)。

筆者所在課題組首次對(duì)泰順縣獼猴桃栽培果園常見病害進(jìn)行了周年調(diào)查，確定了當(dāng)?shù)夭煌竟?jié)的主要病原菌，并預(yù)測(cè)了潛在可能發(fā)生的病害，調(diào)查結(jié)果將為泰順縣后期結(jié)合預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)形成適合本地的綜合防治技術(shù)，提高獼猴桃整體生產(chǎn)管理水平奠定理論基礎(chǔ)。

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