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      庫爾勒香梨黑頭病病原菌的分離鑒定

      2019-09-23 06:10:53歐陽輝張偉達程少波
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年14期
      關(guān)鍵詞:鑒定致病菌

      歐陽輝 張偉達 程少波

      摘要:為了分離、鑒定庫爾勒香梨黑頭病病原菌,并結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等手段對致病菌進行鑒定,采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板法對致病菌株進行分離純化,觀察病原菌株的菌落特征,通過顯微鏡觀察病原孢子形態(tài)特征,并根據(jù)回接試驗確定其致病性能。結(jié)果表明,從病梨萼端表面及香梨生長環(huán)境中共分離出11株菌株,綜合病原菌菌落形態(tài)、孢子顯微結(jié)構(gòu)及回接試驗,篩選出2株候選菌株(SY-6、XL-6),其回接香梨的病癥與正常發(fā)病的香梨較相似。通過十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,簡稱CTAB)法提取病原菌DNA,經(jīng)rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS-rDNA)基因片段測序及美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,簡稱NCBI)網(wǎng)站的同源性比對,鑒定得出SY-6、XL-6均屬于鏈格孢屬。結(jié)果共分離出2株鏈格孢屬病原菌,致病癥狀與自然發(fā)病的香梨較相似,結(jié)果與筆者所在課題組的前期研究結(jié)果相吻合,從而為研究病原菌致病機制提供了參考。

      關(guān)鍵詞:庫爾勒香梨;黑頭病;致病菌;鑒定

      中圖分類號: S436.612.1+9 ?文獻標志碼: A ?文章編號:1002-1302(2019)14-0116-04

      庫爾勒香梨是新疆地區(qū)最主要的特色果品之一,由于其皮薄汁豐、品質(zhì)優(yōu)良而享譽全國。新疆得天獨厚的地理優(yōu)勢和氣候條件造就了庫爾勒香梨獨特的口感和品質(zhì),庫爾勒香梨果實大小適中,形如紡錘,果皮黃綠,果味濃芬,果肉酥脆爽口,清甜多汁,其含糖量約為10%,含水量約為86%,同時富含多種維生素[1]。庫爾勒香梨不但具有很高的食用價值,還有潤肺、涼心、消疾、驅(qū)毒、切片貼燙火傷止痛不爛等藥用功效,深受廣大消費者青睞。

      近年來,新疆香梨的種植面積及貯藏容量在逐年增加。據(jù)統(tǒng)計,截至2016年,新疆香梨種植面積達7萬hm2,產(chǎn)量為114萬t[2],2016年僅出口產(chǎn)值便達407.62萬美元。由于經(jīng)濟價值高、種植面積不斷擴增、產(chǎn)量高,香梨的貯藏保鮮成為一個關(guān)鍵問題,經(jīng)過多年技術(shù)攻關(guān),貯藏冷庫成為目前果農(nóng)的一項選擇,但是香梨在貯藏過程中容易受到病害影響,例如凍害、病蟲害、褐斑病、輪紋病、炭疽病、青霉病、褐腐病及黑頭病等[3],這些病害嚴重降低了商品價值,尤其是庫爾勒香梨黑頭病,其發(fā)病率高達10%,已經(jīng)成為制約香梨鮮果品質(zhì)提升的主要問題。2011年,唐文娟等通過對黑頭病病原菌致病性的研究發(fā)現(xiàn),其主要侵染特征[4]表現(xiàn)為果實萼端深綠色,且硬度較高;發(fā)病初期萼端果皮變黑色,表皮切開后可發(fā)現(xiàn)果肉有淺褐色蜂窩狀壞死現(xiàn)象,且表觀呈現(xiàn)未病變狀態(tài)的果肉組織略有苦味;發(fā)病后期黑頭部位稍有塌陷,萼端產(chǎn)生黑色霉層,病斑邊緣處果皮變?yōu)楹谏“吲c內(nèi)部好果肉的交界非常明顯,呈蜂窩狀的黑頭病部位在伴隨黏稠黑汁狀物質(zhì)產(chǎn)生的同時,存在侵染性腐爛由果皮向果肉逐漸擴散的現(xiàn)象。由于該疾病在香梨貯藏期間高發(fā),同時又嚴重影響香梨的貯藏品質(zhì),所以為了降低香梨發(fā)病造成的經(jīng)濟損失,同時避免這種病害長期存在,對黑頭病致病菌的研究是非常必要的。

      本研究采用分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法對病原菌進行鑒定,以期為香梨黑頭病抗病機制的研究及防治提供理論依據(jù),從而降低黑頭病發(fā)病率,延長香梨貯藏時間,提高香梨品質(zhì)并促進其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      本研究所用庫爾勒香梨(健康果及病果)均于2016年采自庫爾勒市冷藏庫及氣調(diào)庫;庫爾勒香梨樹葉及土壤樣本采自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第二師28團香梨果園。

      馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基[5],購自青島海博生物技術(shù)有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,簡稱CTAB)提取液(200 mL)[6],購自生工生物工程(上海)股份有限公司;DNA純化試劑盒,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡稱SDS),購自北京博奧拓達科技有限公司;酚-三氯甲烷-異戊醇混合液,購自北京索萊寶科技有限公司;Gold View,購自北京博奧拓達科技有限公司。

      LabCycler-PCR擴增儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司(Thermo Fisher Scientific);QUANTUM ST4全自動凝膠成像儀,北京五洲東方科技發(fā)展有限公司;1645056高壓電泳儀,北京六一生物科技有限公司;FRESCO 21離心機,賽默飛世爾科技(中國)有限公司(Thermo Fisher Scientific)。

      1.2 菌株的分離純化及保存

      1.2.1 環(huán)境中病原菌的篩選 準確稱取10.0 g土壤樣品,于PDA液體培養(yǎng)基中富集,在搖床上于28 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h,吸取200 μL培養(yǎng)液至PDA固體培養(yǎng)基上,涂布均勻,于28 ℃倒置培養(yǎng)。從梨樹枝條上摘取大小形態(tài)完整、無明顯病態(tài)的葉片,用75%乙醇棉球擦拭表面,再用無菌水沖洗3次后自然晾干。用滅菌的打孔器取直徑為0.5 cm的葉片切片,放置于PDA固體培養(yǎng)基中,于28 ℃倒置培養(yǎng)。待長出菌落后,將所有菌落采用劃線法或點植法轉(zhuǎn)接純化,直至出現(xiàn)單一穩(wěn)定的菌落。菌落每次轉(zhuǎn)接均設(shè)3組重復(fù)。將最終分離的菌落回接未染病香梨進行致病性能的確定。

      1.2.2 發(fā)病香梨表面病原菌的分離篩選 依據(jù)柯赫氏法則[7]從庫爾勒香梨的病健相接處切下3處病變組織,在PDA固體培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)。待長出菌落后,將所有菌落采用劃線法或點植法轉(zhuǎn)接純化5次,直至分離出菌落大小、形狀、顏色、表面光滑濕潤程度、菌絲生長速度、菌絲形狀、產(chǎn)孢情況、孢子顏色、形狀等一致的若干菌株[8]。病變香梨樣品有15個,每個香梨設(shè)3組平行,菌落每次轉(zhuǎn)接均設(shè)3組重復(fù)。最終將初分離得到的菌落回接到未致病香梨果實上得到致病香梨,進而與未致病香梨比較,進行致病性能的確定。

      1.2.3 病原菌的保存 用液體培養(yǎng)法將分離純化后的致病菌培養(yǎng)至對數(shù)期,保存于50%滅菌甘油(用蒸餾水配制)中,于-80 ℃保存。與此同時,將病原菌接種在斜面固體PDA培養(yǎng)基中,培養(yǎng)3 d后,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.3 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

      將已分離純化的菌種接種在PDA固體培養(yǎng)基平板上,于28 ℃培養(yǎng),自第4天開始觀察菌落的生長狀況。病原菌菌落形態(tài):觀察分離培養(yǎng)基上病原菌的菌落形態(tài)(包括形狀、大小、菌落色澤、菌落表面結(jié)構(gòu)、菌落滲出物及菌落邊緣特征)。菌落形態(tài)特征的描述參照《真菌鑒定手冊》[9]《中國真菌志》[10]《植物病原真菌學(xué)》[11]及《真菌的形態(tài)和分類》[12]。

      1.4 回接試驗

      從氣調(diào)貯藏庫選取健康的庫爾勒香梨果實,于室溫放置6 h后,在無菌條件下,用75%乙醇棉球表面擦拭消毒,后用無菌水沖洗5次,自然晾干,進行接種。用無菌打孔器在庫爾勒香梨萼部分別打3個直徑為0.5 cm、深度為0.2 cm的孔用于接種,取相同直徑的病原菌餅接種于打孔處,將單果實獨立分裝于無菌密封袋中,室溫存放。用分離出的每個病原菌分別接種香梨果實,每個菌種為1個處理,每個處理重復(fù)3次。在25 ℃、相對濕度(RH)保持在90%以上培養(yǎng)5~15 d后對其進行觀察,若癥狀與致病香梨癥狀一樣,則初步確定該菌株為病原菌。

      1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

      1.5.1 病原菌的DNA提取 采用CTAB法對病原菌DNA進行提取。

      1.5.2 PCR擴增病原菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS區(qū)) ITS-rDNA基因片段擴增采用通用引物,上引物為ITSF(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′),下引物為ITSR(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。20 μL PCR擴增體系如下:1 μL DNA模板,0.5 μL 上游引物,0.5 μL下游引物,10 μL預(yù)混液Mix,8 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序如下:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個循環(huán);72 ℃ 7 min。

      反應(yīng)完成后,取3 μL PCR產(chǎn)物,加1 μL 6×loading buffer,混勻后點樣于0.8%瓊脂糖凝膠,電泳后在紫外光下觀察特異性條帶。

      1.5.3 PCR擴增產(chǎn)物的純化回收 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)全式金瓊脂糖回收試劑盒回收純化。

      1.5.4 ITS區(qū)基因的克隆轉(zhuǎn)化 將回收純化產(chǎn)物與T載體(PMD19-T)連接(載體與目的片段摩爾比為1 ∶ 3),然后轉(zhuǎn)化Escherichia coli感受態(tài),篩選陽性克隆[13],進行測序。

      1.5.5 質(zhì)粒提取及測序 篩選陽性克隆,于37 ℃搖床培養(yǎng)12 h,提取大腸桿菌質(zhì)粒,送相關(guān)公司測序。質(zhì)粒提取步驟參考溫建新等的大腸桿菌質(zhì)粒提取方法[14]。ITS-rDNA測序由北京華大基因研究中心完成。將測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比對(BLAST),獲得重復(fù)率最高的相關(guān)屬及相關(guān)種的基因序列,并根據(jù)遺傳距離計算結(jié)果繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 病原菌的分離篩選

      以貯藏于冷庫的自然發(fā)病香梨及生長環(huán)境中采集的土壤、樹葉為材料,經(jīng)分離篩選、純化,得到11株病原菌,其中從土壤中分離出1株(命名為TR-1),從樹葉中分離出5株(分別命名為SY-2、SY-3、SY-4、SY-5、SY-6),從病梨中分離出5株(分別命名為XL-2、XL-3、XL-4、XL-5、XL-6)。

      通過觀察病原菌菌落形態(tài),發(fā)現(xiàn)2株菌SY-6、XL-6在生長初期為灰白色,氣生菌絲薄層絮狀,隨著生長時間的延長及孢子的產(chǎn)生,逐漸表現(xiàn)為淺綠色直至褐色,菌落有明顯的同心輪紋,中心突起且泛白,質(zhì)地緊致,呈氈狀,表面呈現(xiàn)溝紋狀,基底為墨綠色,生長后期培養(yǎng)基呈黑色,菌落邊緣處有1道寬約0.2~0.4 cm的白色菌絲體。這與筆者所在課題組前期研究結(jié)果,即黑頭病病原菌鏈格孢屬的菌落形態(tài)較接近,初步判定菌株SY-6、XL-6為鏈格孢屬。

      2.2 病原菌的顯微觀察

      通過對菌株進行顯微觀察,在高倍鏡下觀察孢子形態(tài),由圖1可以看出,SY-6、XL-6病原菌孢子串生、有橫隔且孢子呈長卵形,與鏈格孢屬較為相似。

      2.3 回接試驗

      將分離純化得到的致病菌菌株(SY-6、XL-6)采用有傷回接(菌餅)法進行試驗,由圖2可知,接種后香梨的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病香梨相似。2株致病菌于庫爾勒香梨上在生長初期為灰白色,氣生菌絲薄層絮狀,隨著生長時間的延長,逐漸變?yōu)闇\綠色直至褐色,菌落有明顯的同心輪紋,中心突起且泛白,質(zhì)地緊致、氈狀,表面呈現(xiàn)溝紋狀,基底為墨綠色,生長后期培養(yǎng)基呈黑色,菌落邊緣處有1道寬約0.2~0.4 cm的白色菌絲體。初步判定病原菌株SY-6、XL-6為鏈格孢屬。

      2.4 黑頭病致病菌的分子生物學(xué)鑒定

      2.4.1 致病菌的DNA提取及擴增 采用CTAB法提取菌株(SY-6、XL-6)的基因組DNA,并進行PCR擴增,以ITSF、ITSR通用引物擴增致病菌的ITS-rDNA,對PCR擴增產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明,PCR擴增產(chǎn)物均有條帶,且條帶單一,無其他雜帶出現(xiàn),電泳結(jié)果見圖3,根據(jù)電泳圖中marker Ⅱ分子量大小的比對可知,致病菌的ITS-rDNA基因序列片段大約為600 bp。

      2.4.2 PCR產(chǎn)物回收純化 將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)全式金瓊脂糖回收試劑盒回收純化,并進行電泳檢測。由圖4可以看出,回收結(jié)果均有條帶,且條帶單一,回收效果良好。

      2.4.3 克隆轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取 將純化后的DNA由T載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞,進行抗生素藍白選擇性培養(yǎng),成功挑選白色單菌落,于37 ℃搖床培養(yǎng)10~12 h后,提取質(zhì)粒,質(zhì)粒提取結(jié)果表明,SY-6、XL-6條帶清晰明亮,質(zhì)粒提取較成功,電泳檢測結(jié)果見圖5。

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