宋小飛 芮偉康 陶書田

摘要：以田間多年生碭山酥梨果實及其誘導的愈傷組織為試驗材料，通過施用不同濃度CaCl2（0、0.25%、0.50%、0.75%），探究抑制石細胞形成的適宜鈣濃度。結(jié)果表明，一定濃度的鈣離子能夠降低肉桂醇脫氫酶的活性，抑制木質(zhì)素的合成，降低石細胞含量，且以0.50% CaCl2效果最佳。不同種類及配比的激素對愈傷組織的誘導及繼代培養(yǎng)效果不同，篩選出MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA為最適的碭山酥梨果實誘導培養(yǎng)基，MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT為最適的繼代培養(yǎng)基。與田間材料和愈傷組織為研究對象的試驗結(jié)果顯示一致，由此推測外界因素對鈣調(diào)控木質(zhì)素合成的影響較小，適宜濃度的CaCl2能夠顯著降低田間梨果實中的石細胞含量，提高食用品質(zhì)。

關鍵詞：碭山酥梨;石細胞;愈傷組織;鈣;木質(zhì)素;肉桂醇脫氫酶

中圖分類號： S661.201 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0148-05

作為我國第三大果樹，梨樹在我國具有悠久的栽培歷史，其栽培面積和產(chǎn)量均居世界前列。碭山酥梨（Pyrus bretschneideri Rehd）原產(chǎn)于我國安徽省宿州市碭山縣，是我國最重要的梨樹資源之一[1]，其豐產(chǎn)性好，果實品質(zhì)優(yōu)良、耐貯性好[2]，深受廣大種植者及消費者的喜愛。但近些年來，由于品種退化或栽培管理不善等原因，碭山酥梨果實石細胞含量增多，果肉變粗，果肉多渣，嚴重影響其風味和品質(zhì)[3-4]。以木質(zhì)素為主要組成成分的石細胞是一種木質(zhì)化的細胞，其含量是影響梨果實品質(zhì)的關鍵因素之一。通過施用礦質(zhì)元素可以抑制梨果實木質(zhì)素合成、減少石細胞含量。王紀忠等研究了施用硼酸、氯化鋅等礦質(zhì)元素對降低梨果實石細胞含量的作用，并取得了一定的成果[5-6]。

鈣（Ca）是細胞壁、細胞膜的重要組成成分，在維持細胞壁、細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性、減少膜的損傷等方面具有重要作用[7]。同時，鈣作為細胞功能調(diào)節(jié)的第2信使，能夠參與植物體內(nèi)各種生理生化反應，調(diào)節(jié)植物細胞對各種脅迫信號的轉(zhuǎn)導過程[8-9]。目前，關于鈣元素促進植物生長及改善果實品質(zhì)的報道較多[10-15]。但關于探索適合抑制碭山酥梨果實生長發(fā)育過程中石細胞生成的鈣濃度卻鮮有報道。

梨樹作為多年生植物，在田間試驗處理時，由于多種不確定因素的存在，試驗結(jié)果的準確性受到影響，并且單一影響因素很難控制。而離體愈傷組織為試驗研究提供了一個可控的環(huán)境，使任何單一因素的研究成為可能[16]。為了探究抑制梨果實石細胞形成的適宜鈣濃度，本研究通過對田間碭山酥梨果實及愈傷組織施用不同濃度的氯化鈣，分析木質(zhì)素含量及相關酶活性的變化，以期為通過栽培技術抑制石細胞形成和提高果實食用品質(zhì)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試肥料為無水CaCl2，折合含鈣量約36%。MS培養(yǎng)基（不加瓊脂和蔗糖）由青島高科園海博生物技術有限公司生產(chǎn);蔗糖由西隴化工股份有限公司生產(chǎn);瓊脂由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

本研究于2017年在江蘇省高郵市夏集鎮(zhèn)梨果園進行，選用健康優(yōu)良、長勢旺盛、管理水平一致的50年生碭山酥梨果樹為試驗材料。愈傷組織誘導材料為碭山酥梨盛花后21～35 d無任何處理的果實，從田間采集放置冰盒中，當天運回實驗室置于4 ℃冰箱中保存。田間試驗設4個處理組，分別含CaCl2量為0（CK）、0.25%、0.50%、0.75%。每個處理重復3次，單株小區(qū)，完全隨機區(qū)組排列。在梨生長發(fā)育期間噴施葉面3次，分別是在盛花期、坐果期和生理落果期后2周。每次噴施量以葉面滴水為度，其他管理措施同常規(guī)管理方法。采樣從第2次噴施鈣肥之后開始，定期采樣至果實成熟，每次隨機采20～30個（幼果期適當多采），所采梨果實及時放入帶有冰袋的采樣盒中，當天帶回實驗室。除部分果實直接用于生理指標的測定外，其余果實去皮后將果肉切碎混合均勻，經(jīng)液氮速凍后貯存于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 碭山酥梨果實愈傷組織試驗體系的建立 將采回的幼果置于流水中沖洗10 min。在超凈工作臺內(nèi)，先用75%乙醇處理幼果1 min，然后用無菌水洗滌3遍，再用8.5%次氯酸鈉處理9 min，最后用無菌水洗滌4遍。使用鑷子和手術刀去皮，切成薄塊，置于誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)（表1）。將誘導出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加不同激素種類及配比的繼代培養(yǎng)基（表2）上，每5 d測定愈傷組織生長量，測定公式為愈傷組織生長量（g）=當天測定時愈傷組織鮮質(zhì)量-接種時愈傷組織鮮質(zhì)量。多次繼代后篩選出生長一致、活力旺盛的愈傷組織作為試驗材料，分別培養(yǎng)在含有不同CaCl2濃度[0（CK）、0.25%、0.5%、0.75%]的培養(yǎng)基上。

本試驗所用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，瓊脂0.75%，蔗糖3%，pH值5.75～5.80，培養(yǎng)基裝瓶后在121 ℃下高溫滅菌20 min，于（25±1） ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.2 愈傷組織鈣含量的測定 采用微波消解儀（Ethos T，Milestone公司，意大利）結(jié)合電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP，Optima 2100DV，Perkin Elmer公司，美國）測定繼代培養(yǎng)10 d的愈傷組織中的鈣含量。稱取烘干的愈傷組織0.1 g，放在消煮管中，在消煮管的外管中加入超純水8 mL，再向消煮管中加入硝酸2 mL，在110 ℃環(huán)境下消煮10 min之后，依次升溫至130 ℃和150 ℃，消煮10 min，最后于280 ℃環(huán)境下消煮1 h。將液體在50 mL容量瓶中定容，采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀測定。

1.2.3 木質(zhì)素含量的測定 準確稱取0.01 g果肉（愈傷組織）粉末樣品，用95%無水乙醇充分研磨，并定容至5 mL，10 000 g 下離心棄上清液，先用95%乙醇清洗沉淀3次，再用乙醇 ∶ 正己烷=1 ∶ 2（體積分數(shù)）溶液沖洗3次，烘干。加入 2 mL 25%溴乙酰醋酸溶液，于70 ℃保溫30 min，加入0.9 mL 2 mol/L的NaOH溶液終止反應，另加5 mL乙酸和0.1 mL 7.5 mol/L 的氯化羥胺，用乙酸定容至10 mL，利用多功能酶標儀（Bio-Tex Cytation 3公司，意大利）于280 nm處測定吸光值，并通過木質(zhì)素標準品（Sigma-Aldrich公司，美國）曲線查得木質(zhì)素含量[17]。

1.2.4 石細胞含量的測定 石細胞含量的測定參照Syros等的方法[17]，并稍加改動，具體操作步驟如下：取大小均勻一致的3個果實（幼果適當增加），去掉果皮，取食用部分，按四分法取樣，準確稱取100 g，置于-20 ℃低溫冰箱冷凍24 h。樣品取出置于室溫自動解凍后，加入200 mL蒸餾水，并用組織搗碎機（1 000～1 500 r/min）連續(xù)搗碎3 min。將勻漿轉(zhuǎn)移到1 000 mL的燒杯中，加入700 mL蒸餾水，用玻璃棒不斷攪拌 1 min，靜置3 min，使石細胞充分沉降在底層。倒出上層懸浮液，將沉淀物懸浮于0.5 mol/L鹽酸中30 min，棄去漂浮物，用蒸餾水反復漂洗5～6次，將前幾次漂浮傾出的懸浮液收集并漂洗。收集所得的石細胞用粗濾紙過濾，分離得到純凈的石細胞，烘干至恒質(zhì)量，稱量，重復3次，取平均值。

1.2.5 石細胞組織定位 石細胞的組織定位采用徒手切片法，將梨果實沿橫切面切開，然后迅速滴加35%濃鹽酸在橫切面上，約2 min后滴加1%間苯三酚顯色30 s[18]。

1.2.6 肉桂醇脫氫酶的提取與活性測定 將Goffner等的方法優(yōu)化后進行酶液的提取與酶活性的測定[19]。具體操作如下：取少量冷凍樣品，用液氮充分研磨至粉末狀，取0.4 g研磨粉末，加入適量磷酸緩沖液（0.1 mmol/L，pH值6.25，含 15 mmol/L 巰基乙醇、2%聚己二醇、1%聚乙烯吡咯烷酮、20 mmol/L 氧化型輔酶Ⅱ），渦旋5 min，于4 ℃條件下 18 000 g 離心15 min，上清液全部轉(zhuǎn)入刻度試管，記錄其準確體積后進行活性測定。

1 mL酶反應體系包括800 μL反應液（含10 mmol/L氧化型輔酶Ⅱ、5 mmol/L反式肉桂酸），200 μL粗酶液，以 800 μL 反應液加200 μL磷酸緩沖液為對照。將反應液混勻后放入37 ℃恒溫水浴，30 min時立即加入0.5 mL 1 mol/L HCl終止反應。之后4 ℃條件下5 000 g離心5 min以除去變性蛋白，于340 nm處測定上清液的吸光度。酶活性以1 min吸光度增加0.001為1個酶活性單位。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用Excel進行數(shù)據(jù)整理，SPSS 20.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨果實愈傷組織的誘導與繼代培養(yǎng)

將滅菌后的梨果實切成小塊，接種到含有不同種類及配比的培養(yǎng)基上進行誘導，不同種類誘導培養(yǎng)基的誘導率見表3。8號培養(yǎng)基（MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA）誘導率最高，達95%，是最適的碭山酥梨果實愈傷組織誘導的培養(yǎng)基。

將培養(yǎng)25 d的初代愈傷組織接種到不同類型的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，細胞不斷分裂增殖，愈傷組織不斷增大（圖1）。在所設定的3種類型培養(yǎng)上，愈傷組織均有所增大，且各培養(yǎng)基中愈傷組織增殖率差異明顯。培養(yǎng)至30 d時1號培養(yǎng)基（MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT）上愈傷組織質(zhì)量增加最大，增加了1.59 g，而2號和3號培養(yǎng)基僅分別增加了1.15、1.01 g。此外，2號和3號培養(yǎng)基中的愈傷組織在25 d就進入緩慢生長期，而1號培養(yǎng)基中的愈傷組織在30 d才進入緩慢生長期。綜上所述，1號培養(yǎng)基愈傷組織增殖量大，繼代周期長，是碭山酥梨最適的繼代培養(yǎng)基，本試驗材料選擇在1號培養(yǎng)基上連續(xù)繼代多次后形成的乳白色、活力旺盛、生長速度快的愈傷組織。

2.2 不同濃度鈣處理下愈傷組織鈣含量的變化

利用連續(xù)繼代多次的愈傷組織作為材料，測定不同濃度鈣處理下，繼代培養(yǎng)10 d的愈傷組織中的鈣含量，結(jié)果如圖2所示。4組處理的愈傷組織鈣含量存在顯著差異，愈傷組織中的鈣含量與培養(yǎng)基中的鈣離子濃度呈正相關關系。CK中的鈣含量為 5.95 mg/L， 而含有 0.75% CaCl2培養(yǎng)基中的愈傷組織鈣含量到達15.51 mg/L，是對照組的2倍多。培養(yǎng)基中過高濃度的鈣含量會導致愈傷組織生長受抑制，含 0.75% CaCl2培養(yǎng)基中的愈傷組織在15 d時便停止生長，出現(xiàn)褐化現(xiàn)象并最終死亡。

2.3 木質(zhì)素含量的變化

碭山酥梨果肉中木質(zhì)素含量在果實生長發(fā)育過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖3）。CK中在幼果期，木質(zhì)素逐漸積累，盛花后48 d果肉中木質(zhì)素含量達到最大值7.8%，而后果肉中木質(zhì)素含量逐漸降低，直至果實成熟時降到最低值。

不同濃度CaCl2對果肉中木質(zhì)素的形成影響不同。盛花后 48 d，3種不同濃度CaCl2處理的果肉中木質(zhì)素含量均顯著低于CK，0.50% CaCl2處理的果肉中木質(zhì)素含量為CK的 55.64%。

如圖4所示，愈傷組織生長過程中木質(zhì)素含量呈下降趨勢，繼代培養(yǎng)至20 d時，0.50% CaCl2處理組愈傷組織中木質(zhì)素含量顯著下降。在繼代培養(yǎng)10 d時，0.25% CaCl2處理的愈傷組織中木質(zhì)素含量最高，但與其他處理之間差異不顯著。0.50% CaCl2處理的愈傷組織中木質(zhì)素含量始終低于其他處理，在繼代培養(yǎng)周期結(jié)束時，該處理中的木質(zhì)素含量最低，僅為對照的57.8%。

2.4 碭山酥梨果實發(fā)育過程中石細胞含量的變化

碭山酥梨果實中石細胞含量的變化趨勢與果肉中木質(zhì)素含量的變化趨勢相似，石細胞含量隨著果實不同發(fā)育階段而發(fā)生變化（圖5）。CK中石細胞含量在果實發(fā)育初期逐漸增加， 從盛花后21 d開始果實內(nèi)石細胞含量呈上升趨勢， 盛花

后48 d達到峰值15.43%;而后果肉中石細胞含量逐漸減少，盛花后 85 d 石細胞含量迅速減少，直到果實成熟時果實中的石細胞含量降到最低。

噴鈣處理的果實中的石細胞含量與CK的變化趨勢相似，但不同濃度CaCl2在果實發(fā)育過程中對石細胞含量影響不同。在果實發(fā)育前期，不同濃度CaCl2處理果實中的石細胞含量都高于CK。在盛花后48 d，不同濃度CaCl2處理的果實中石細胞含量也都達到峰值，但比CK中石細胞含量少，其中0.50% CaCl2處理顯著降低了果實中的石細胞含量，僅為 13.42%。果實成熟時，0.50% CaCl2處理的果肉中石細胞含量最少，為0.46%;而0.25% CaCl2處理石細胞含量最高，為0.73%。

2.5 果實石細胞分布觀察

木質(zhì)素與間苯三酚-鹽酸試劑反應呈紅色，該反應是以木質(zhì)素中的松柏醇結(jié)構(gòu)為基礎而產(chǎn)生的[20]。圖6-A 顯示的是幼果期石細胞染色情況，CK與0.25%和0.75% CaCl2處理在顯色上差異不明顯，而在0.50% CaCl2處理中，可以明顯看出石細胞染色較少，說明0.5% CaCl2處理在幼果期明顯減少了石細胞的形成。圖6-B顯示的是成熟果期石細胞染色情況，0.50%和0.75% CaCl2處理的梨中被染成紅色的細胞明顯少于CK和0.25% CaCl2處理，且0.25% CaCl2處理與CK中被染色細胞數(shù)量差異不明顯。這說明 0.5% 和0.75% CaCl2處理減少了成熟果中石細胞的含量和密度，并且0.5% CaCl2處理的效果更顯著。

2.6 肉桂醇脫氫酶活性的變化

由圖7可知，肉桂醇脫氫酶（CAD）活性隨著碭山酥梨果實發(fā)育先逐漸降低，后于盛花后70 d和85 d稍有提高，最后在果實成熟期活性降到最低。在果實發(fā)育初期，CAD活性較高，隨后快速下降。0.75% CaCl2處理在幼果期提高了CAD活性，與CK相比，盛花后48 d 3種濃度CaCl2處理均降低了CAD活性，0.50% CaCl2處理抑制效果最顯著。果實成熟期，0.50% CaCl2處理的CAD活性最高，是對照的4.76倍。

與田間果實中CAD活性變化趨勢相似，CAD活性在繼代培養(yǎng)的愈傷組織中一直下降（圖8），不同濃度CaCl2均能顯著抑制愈傷組織中的CAD活性。在繼代培養(yǎng)過程中，與其他處理相比，0.50% CaCl2處理的愈傷組織中的CAD活性一直最低，且具有顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)有研究基本以田間整株植物作為材料來開展抑制梨果實石細胞形成的研究，但田間試驗存在許多不確定因素，會影響試驗結(jié)果的準確性。Wang等以碭山酥梨為試驗材料，研究不同果袋對梨果實石細胞形成的影響發(fā)現(xiàn)，果實套袋能夠明顯減少石細胞含量[21];而王丹陽研究卻發(fā)現(xiàn)，套袋顯著提高了梨果實中的石細胞含量[22]。造成這種差異的原因，除了與選用不同的果袋有關，還可能與田間管理操作及當?shù)貧夂驐l件等因素有關。本研究針對田間生產(chǎn)過程中鈣離子噴施濃度不確定、吸收效果難以控制等現(xiàn)象，利用愈傷組織為試驗材料，來驗證田間試驗的準確性，以減少自然環(huán)境變化對梨果實木質(zhì)素合成的干擾。但由于植物組織培養(yǎng)受外界影響的因素較小，在培養(yǎng)基中施加鈣元素不會流失，本研究0.75% CaCl2處理的培養(yǎng)基中，愈傷組織的鈣含量過高，并因此出現(xiàn)愈傷組織生長受抑制和褐化嚴重的現(xiàn)象，因此考慮0.75% CaCl2處理的培養(yǎng)基中愈傷組織不具備作為試驗材料的條件。以0.25%和0.50% CaCl2處理的培養(yǎng)基中的愈傷組織為研究對象，與田間處理條件相對應，對不同濃度鈣影響梨果實石細胞的形成進行分析。

石細胞是一種厚壁組織細胞，由木質(zhì)素在初生細胞壁上沉積并通過細胞壁次生加厚而形成，由于具有硬化的壁而被稱為石細胞。木質(zhì)素是梨果實石細胞的主要成分，石細胞中的木質(zhì)素含量高達29.83%[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，田間果實中木質(zhì)素及石細胞含量在果實發(fā)育中期（盛花后48 d）達到最大值，這一結(jié)果與Ma等的研究結(jié)果[23-24]一致，說明果實發(fā)育中期是石細胞形成的關鍵時期，此時抑制木質(zhì)素合成相關酶的活性，會導致梨果實中石細胞含量減少。0.50% CaCl2處理的愈傷組織中的木質(zhì)素含量，在生長過程中一直最低，而該處理的田間果實中木質(zhì)素及石細胞含量，從果實發(fā)育中期到成熟期始終低于其他處理。果實切片染色觀察可用于分析石細胞在果實中的分布情況，結(jié)果表明，無論是在幼果期還是在成熟期0.50% CaCl2處理中的石細胞分布密度最小[18]。結(jié)合田間試驗和以愈傷組織為材料的試驗可以推測，0.50% CaCl2能夠在梨果實生長發(fā)育期間抑制木質(zhì)素合成，降低果實中的石細胞含量，是田間噴施的適宜鈣濃度。

CAD作為植物次生代謝特別是木質(zhì)素合成的關鍵酶，作用于木質(zhì)素合成反應的最后一步，能通過催化羥基肉桂醛還原為相應的醇類調(diào)節(jié)木質(zhì)素單體合成，其活性的高低影響木質(zhì)素單體的合成。Lu等在萊陽梨貯藏期間噴施0.50% CaCl2發(fā)現(xiàn)，鈣處理能夠明顯降低CAD活性，抑制木質(zhì)素在果肉中的形成，減少貯藏期間果實中的石細胞含量[25]。本試驗結(jié)果表明，不同濃度鈣處理下，愈傷組織CAD活性持續(xù)下降，0.50% CaCl2處理的田間果實中的CAD活性，在石細胞形成的關鍵時期被顯著抑制。而0.50% CaCl2處理的田間果實CAD活性在生長發(fā)育中后期稍有提高，這可能與自然條件下，激素、機械損傷及真菌等外界因素誘導CAD活性發(fā)生改變有關[26]。

適宜濃度CaCl2在梨果實發(fā)育過程中能夠顯著減少木質(zhì)素的合成，并在石細胞形成的關鍵時期抑制CAD活性，降低梨果實中石細胞含量。此外，以碭山酥梨果實愈傷組織為試驗材料的結(jié)果，進一步驗證了田間試驗的準確性。綜上所述，在實際生產(chǎn)中，外界因素對鈣調(diào)控木質(zhì)素合成的影響較小，外源噴施0.50% CaCl2能夠明顯減少梨果實中石細胞含量。當然，參與木質(zhì)素合成過程的酶有十多種，不同濃度外源鈣對各種酶的綜合影響所導致的木質(zhì)素含量的變化，還亟待進一步的研究。

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