李紅歡 陳朔 康立超

摘要：為了解食源性單增李斯特菌分離株的毒力島1（LIPI-1）和毒力島2（LIPI-2）的基因及致病性。利用PCR方法對8株分離株LIPI-1和LIPI-2進行基因檢測，小鼠腹腔接種分離株菌懸液5×107 CFU/只，進行致病性的初步試驗。結(jié)果顯示，LIPI-1的6個毒力基因除actA基因檢出率為50.0%外，hly、prfA、plcA、plcB、mpl的檢出率為100.0%;LIPI-2中inlA、inlB、inlC基因檢出率為100.0%，inlD和inlE基因檢出率分別為87.5%和75.0%，inlF和inlG毒力因子基因的檢出率較低，分別為50.0%和37.5%。小鼠致病性試驗顯示，8株分離株均能致死小鼠，致死率在50.0%～100.0%。其中，LM5567和LM5570在5 d內(nèi)全部死亡，致死率為100.0%，表明這2株菌對小鼠有強致病力。說明LIPI-1基因檢出率高于LIPI-2的基因檢出率;菌株的致病性與毒力島基因的攜帶率無明顯相關(guān)，但分離株對小鼠均有致病性，提示食品安全不容忽視。本研究為食源性單增李斯特菌毒力島基因攜帶率與致病力的關(guān)系提供鋪墊。

關(guān)鍵詞：食源性單增李斯特菌;毒力島1（LIPI-1）;毒力島2（LIPI-2）;致病性;基因檢出率

中圖分類號： S852.61 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0193-04

李斯特菌屬包括單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM或L. monocytogenes）、綿羊李斯特菌（L. ivanuii）、英諾克李斯特菌（L. ivanovii）、羅氏李斯特菌（L. rocourtiae）、默氏李斯特菌（L. marthii）、西爾李斯特菌（L. seeligeri）、格氏李斯特菌（L. grayi）和威爾斯李斯特菌（L. welshimeri）8種菌[1]，其中，LM是食源性李斯特菌病的條件性致病菌，與人的疾病密切相關(guān)，可穿越腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障[2]，在臨床上引起腦炎、腦膜炎、流產(chǎn)和死胎等，同時該菌可引起家禽壞死性肝炎和心肌炎的病理變化[3]。對于人類，特別是新生兒、孕婦、老年人及免疫功能缺陷者易引起疾病，致死率達 20%～30%[4-5]，在新生幼兒和免疫力低下的人群中更高達70%[6]。許多國家已將此菌列為食品微生物安全檢測項目，并對進口食品提出檢驗該菌的嚴格要求[7]。

LM是革蘭氏陽性、無芽胞兼性厭氧胞內(nèi)寄生菌，廣泛存在于自然界中，有較強的環(huán)境適應(yīng)性，可在低溫、高鹽、酸堿等不利的環(huán)境條件下生長繁殖[8]，通過多種途徑進入食品及食品加工環(huán)境。LM是侵襲性胞內(nèi)菌，主要通過污染的食物經(jīng)口進入到宿主的胃腸道內(nèi)，在細菌的黏附侵襲等相關(guān)毒力因子的作用下進入到宿主細胞內(nèi)，通過血液和淋巴循環(huán)系統(tǒng)到達各組織器官，最終引起全身感染[9]。其感染過程包括內(nèi)化、逃離吞噬泡、宿主細胞內(nèi)的極向運動和細胞內(nèi)的傳播，整個感染過程都有相應(yīng)的毒力因子參與，這些毒力因子與LM致病性有關(guān)，參與其主要的致病過程，編碼這些毒力因子的L毒力基因常聚類于毒力島。LM主要有毒力島1（LIPI-1）和毒力島2（LIPI-2）2 個毒力島，毒力島1（LIPI-1）與單增李斯特菌的胞內(nèi)感染相關(guān)[10]，主要由prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB 6個毒力基因組成，毒力島2（LIPI-2）與單增李斯特菌的黏附、侵襲有關(guān)，由inlA、inlB、inlC等多個內(nèi)化素組成。

LM的毒力因子與其致病性有密切聯(lián)系，研究表明，當(dāng)LM缺少某些重要的毒力因子時，LM的毒力將大大降低[11]。因此，研究食源性LM毒力因子攜帶率與致病力的關(guān)系對于人類李斯特菌病的監(jiān)控、暴發(fā)流行的監(jiān)測以及追蹤污染源有重大意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與試驗動物

本試驗所用食品源單增李斯特菌，由新疆農(nóng)墾科學(xué)院食品檢測中心分離鑒定，石河子大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存（表1）。48只6～8周昆明小鼠購自石河子大學(xué)動物實驗中心。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

腦心浸液培養(yǎng)基（BHI），購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司;2×PCR Mix、超純水，均購于北京東盛生物公司;DNA Marker（2000），購于北京東盛生物公司;瓊脂糖，購于Biowest公司;瓊脂，購于Biotopped公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

參考GenBank中登錄的LMF2365基因全長序列（AE017262），用Primer 5.0軟件設(shè)計毒力因子基因引物（表2），毒力島1部分基因引物設(shè)計參考文獻[12]，引物由華大基因公司合成。

1.4 菌株培養(yǎng)

將-80 ℃保存的8株菌種取出，于BHI固體培養(yǎng)基上劃線，并于37 ℃培養(yǎng)20 h，挑取單個菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)16 ～18 h，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分離株毒力島基因PCR擴增及檢測

PCR擴增體系：10 μL 2×PCR mix，6 μL超純水，2 μL菌液，上游引物（25 mmol/L），下游引物（25 mmol/L）各1 μL，總體積20 μL。

PCR擴增條件：（1）hly：95 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃ 10 min。（2）prfA、plcA、plcB、actA、mpl：94 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30個循環(huán);72 ℃ 10 min。（3）inlA、inlB、inlC、inlD、inlE、inlF、inlG：95 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán);72 ℃ 10 min。

取20 μL擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與標準DS2000 DNA Marker比較。

1.6 分離株對小鼠的致病性試驗

將8株LM接種于BHI中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，12 000 r/min離心2 min，棄上清液，用無菌PBS洗滌2次，制備成濃度為108 CFU/mL的菌懸液，取此菌懸液經(jīng)小鼠腹腔注射 0.5 mL/只，每組6只，連續(xù)10 d觀察小鼠死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株毒力島基因PCR擴增結(jié)果

用LIPI-1相應(yīng)的引物分別對hly、prfA、plcA、plcB、actA、mpl基因進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，與DS2000相比，片段長度分別約為743、373、371、286、286、399 bp，均符合預(yù)期（圖略），表明分離株中含有相應(yīng)的毒力島基因。

用LIPI-2相應(yīng)的引物分別對inlA、inlB、inlC、inlD、inlE、inlF、inlG基因進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，與DS2000相比，片段長度分別大約為255、146、570、432、727、1079、776 bp，均符合預(yù)期（圖略），表明分離株中含有相應(yīng)的毒力島基因。

2.2 分離株毒力島基因的檢測結(jié)果

采用PCR方法檢測分離株的毒力島基因，LIPI-1和LIPI-2基因在菌株中的檢出率（表3）顯示，不同毒力基因的檢出率不同。LIPI-1有5個毒力基因的檢出率為 100.0%，分別為hly、prfA、plcA、plcB和mpl;actA基因的檢出率為50.0%。LIPI-2有3個毒力基因的檢出率為100%，分別為inlA、inlB和inlC;inlD基因的檢出率為87.5%;inlE基因的檢出率為75.0%;inlF和inlG 2個毒力基因檢出率相對較低，僅為50.0%和37.5%。由此可見，8株分離株中LIPI-1毒力島基因檢出率高于LIPI-2。

8株食源性LM分離株中，LM5570和LM5470僅存在actA毒力基因的缺失，毒力島基因的攜帶率最高，為92.31%（12/13），LM5563和LM5567缺失inlE、inlF、inlG基因，毒力島基因的攜帶率最低，為76.92%（10/13），其余LM分離株均缺失2個毒力基因。

2.3 不同分離株對小鼠致病性試驗

采用對小鼠腹腔注射細菌懸液5×107 CFU/只，感染小鼠12 h均表現(xiàn)精神沉郁、行動緩慢、食欲低下，接種的小鼠死亡時間集中在3～5 d，6 d后不再有小鼠死亡。LM5567、LM5570菌株接種小鼠在5 d內(nèi)全部死亡，死亡率為100.00%;LM4786、LM4788、LM5470和LM5474菌株接種小鼠死亡率為83.33%，其中LM5470和LM5474菌株接種小鼠，4 d內(nèi)死亡5只小鼠，LM4786和LM4788菌株接種小鼠，6 d內(nèi)死亡5只小鼠。LM5573菌株接種小鼠，5 d內(nèi)死亡4只，死亡率為 66.67%。LM5563菌株接種小鼠，5 d內(nèi)死亡3只小鼠，死亡率為50.00%。LM5570和LM5470毒力島基因的攜帶率最高（12/13），死亡率為100.00%和83.33%;LM5567和LM5563毒力島基因的攜帶率最低（10/13），死亡率為100.00%和 50.00%;LM5474、LM4786、LM4788和LM5573基因攜帶率為84.62%（11/13），死亡率分別為83.33%、83.33%、83.33%和66.67%（表4）。表明8株分離株均能致死小鼠，但不同分離株致死率不同，且與基因攜帶率無明顯相關(guān)。

2.4 各菌株毒力島基因與小鼠致病力的關(guān)系

含有相同毒力基因的LM菌株所表現(xiàn)的致病力并不相同，LM5470和LM5570所含毒力因子相同，均缺少actA毒力因子，但小鼠死亡時間和死亡率并不同。感染LM5470的小鼠，1 d后開始死亡，4 d內(nèi)死亡5只，死亡率為 83.33%;感染LM5570的小鼠，3 d后開始死亡，5 d內(nèi)6只實驗小鼠全部死亡，死亡率為100%。結(jié)果表明，LM5570致病力較強于LM5470菌株。

LM4788和LM5573所含毒力因子相同，均缺少inlF和inlG毒力因子，小鼠死亡時間和死亡率并不同;感染LM4788的小鼠，5 d后開始死亡，6 d內(nèi)死亡5只，死亡率為83.33%;感染LM5573的小鼠在4 d后開始死亡，5 d內(nèi)死亡4只，死亡率為66.67%。結(jié)果表明，LM5567致病力較LM4788強。

LM5563和LM5567所含毒力因子相同，均缺少inlE、inlF和inlG毒力因子，但小鼠死亡時間和死亡率并不同。感染M5563的小鼠，5 d內(nèi)死亡3只小鼠，死亡率為50.00%;感染LM5567的6只小鼠在5 d內(nèi)全部死亡，死亡率為100.00%。結(jié)果表明，LM5567的致病力較LM5563強。

上述結(jié)果表明，含有相同的毒力島基因的分離株對小鼠的致死率并不相同，菌株基因的攜帶率與其致病性無明顯相關(guān)，表明對LIPI-1和LIPI-2的基因檢測不足反映其與致病力的關(guān)系。

3 討論

LM一般經(jīng)胃腸道感染，侵入腸上皮細胞后被單核巨噬細胞吞噬，并隨著擴散到局部淋巴結(jié)，最后到達內(nèi)臟器官，引起全身性感染[12]。李斯特菌整個感染過程中的每一步均有特定的毒力因子調(diào)控。LM的致病性與其毒力基因密切相關(guān)，缺失毒力基因?qū)?dǎo)致其致病性的消失或者下降。通過檢測毒力基因，可以掌握這些毒力基因在LM中的分布，從而為評估LM分離株的致病性強弱提供理論基礎(chǔ)。

本研究通過PCR技術(shù)檢測了8株不同來源食源性LM分離株LIPI-1和LIPI-2的13個毒力基因，有研究表明 LIPI-1 毒力島與LM的致病性密切相關(guān)，是細菌在細胞內(nèi)生存必不可少的，具有高度的保守性[13]。本試驗中LIPI-1基因除actA之外，其余基因均未缺失，檢出率為100.0%，具有較高的穩(wěn)定性，LIPI-1基因的檢出率高于伊娜娜等的報道[14-15]，說明本區(qū)域的食源性LM分離株LIPI-1的基因的檢出率較高。LIPI-2與LM的黏附、侵襲有關(guān)，inlA、inlB和inlC的檢出率達100.0%，inlD、inlE、inlF和inlG的檢出率分別是87.5%、75.0%、50.0%和37.5%，LIPI-1基因檢出率高于LIPI-2基因，本試驗結(jié)果與劉二龍等的報道[16-18]一致。

本研究中將不同分離株對小鼠進行致病性試驗表明，8株LM分離株均能致死小鼠，但不同分離株致死率不同，其致死率與所檢測毒力島基因攜帶率之間無明顯相關(guān)，提示目前所檢測的菌株數(shù)量或毒力島基因不足以反映菌株的致病力，仍需進一步研究，但食品污染LM的安全不容忽視。

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