納米氧化銅對斑馬魚甲狀腺系統(tǒng)的干擾效應(yīng)

王黎曌 薛永來 高璐

摘要：目前納米技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用以指數(shù)形式快速增長，納米氧化銅（copper oxide nanoparticles，CuO NPs）因在吸光性、磁性、化學(xué)催化和熱傳導(dǎo)等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢而得到廣泛應(yīng)用，近期關(guān)于CuO NPs對細(xì)胞、動物胚胎和植物的毒性報(bào)道日益增多，但是關(guān)于CuO NPs對魚類甲狀腺系統(tǒng)的報(bào)道相對較少。因此，本試驗(yàn)選用斑馬魚作為研究對象，從細(xì)胞形態(tài)、激素水平和基因?qū)用嫜芯苛思{米氧化銅對斑馬魚甲狀腺系統(tǒng)造成的干擾效應(yīng)。結(jié)果表明，CuO NPs可損傷甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)，改變上皮細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)甲狀腺激素T3和T4上升并且造成代謝酶編碼基因ugt1ab的表達(dá)下調(diào)。

關(guān)鍵詞：納米氧化銅;斑馬魚;甲狀腺濾泡;激素;基因

中圖分類號： S941.91;X174 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0202-04

隨著納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展，納米材料的毒理機(jī)制已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。納米氧化銅（copper oxide nanoparticles，CuO NPs）是一種不溶于水的黑色金屬氧化物，憑借其小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)等良好的物理性能在吸光性、磁性、化學(xué)催化和熱傳導(dǎo)等方面具有優(yōu)勢。因此，CuO NPs廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，在光電子領(lǐng)域，CuO NPs可作為超/熱傳導(dǎo)材料、電子芯片、半導(dǎo)體及傳感器的生產(chǎn)原料[1]。CuO NPs也可用作木材的防腐劑、防毒面具和抗菌涂料，還可以有效地去除羥類和氰化物[2-3]。在大量使用CuO NPs的同時(shí)，一部分CuO NPs會泄露到環(huán)境中，不僅對生態(tài)環(huán)境造成脅迫，還可通過皮膚黏膜接觸和食物鏈等途徑直接危害動物健康。例如，CuO NPs可誘導(dǎo)人體肺部上皮細(xì)胞（A549）產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和P53信號通路的異常[4]。Zhao等研究CuO NPs對青年鯉（Cyprinus carpio）的毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，100 mg/L CuO NPs可在腸道和鰓內(nèi)產(chǎn)生累積效應(yīng)，還阻滯鯉魚的生長發(fā)育[5]。有報(bào)道稱，CuO NPs對植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）[6]和芥菜（Brassica juncea L.）[7]的根發(fā)育和木質(zhì)化形成具有抑制作用。由此可見，CuO NPs對人體細(xì)胞、植物和魚類等具有毒性作用。近年來，斑馬魚（Danio rerio）作為一種新型脊椎動物模型，越來越多地被應(yīng)用在體內(nèi)藥物毒理和功效的篩選及評估化學(xué)物質(zhì)的毒性試驗(yàn)[8-10]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚的基因組、毒性特征、信號傳導(dǎo)與人類高度相似，斑馬魚在解剖學(xué)、生理學(xué)和分子水平上也與哺乳動物相似[11]。但以往納米材料對斑馬魚的毒性研究集中在胚胎發(fā)育毒性和急性毒性方面。曾有人證實(shí)，CuO NPs可引起胚胎的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使乙酰膽堿酯酶和ATP酶失活，抑制胚胎的生長發(fā)育[12];Sun等研究發(fā)現(xiàn)CuO NPs還可影響斑馬魚胚胎的肝臟發(fā)育和視神經(jīng)分化[13];CuO NPs對斑馬魚胚胎的體節(jié)生長、神經(jīng)和心血管發(fā)育同樣也具有一定的影響[14]。

雖然納米材料的急性毒性研究已取得重大的進(jìn)展，但關(guān)于納米材料對魚類的內(nèi)分泌影響的數(shù)據(jù)較少，尤其關(guān)于CuO NPs對處于生長發(fā)育階段的斑馬魚甲狀腺的毒性研究相對匱乏。脊椎動物的甲狀腺系統(tǒng)是重要的內(nèi)分泌系統(tǒng)之一，其分泌的甲狀腺激素（thyroid hormones，THs）包括甲狀腺素（T4）和三碘甲腺原氨酸（T3），在生長發(fā)育、調(diào)節(jié)新陳代謝速率以及維持生殖功能穩(wěn)定和體內(nèi)自穩(wěn)態(tài)等方面起著至關(guān)重要的作用[15-16]。而環(huán)境污染物對生殖和甲狀腺等內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的試驗(yàn)中，斑馬魚也是一種常見的實(shí)驗(yàn)室模式動物[17-18]。因此，本研究選取斑馬魚幼魚（1個(gè)月）作為受試動物，在CuO NPs懸浮液中暴露20 d后，觀察甲狀腺濾泡的病理組織切片，檢測T3和T4的水平，初步探究了納米氧化銅（CuO NPs）對斑馬魚甲狀腺系統(tǒng)的干擾效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

斑馬魚種魚（購自國家斑馬魚資源中心）在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)半個(gè)月以上方可產(chǎn)下胚胎，馴養(yǎng)條件為光照、黑暗周期為12、10 h，水溫保持28 ℃左右，投喂豐年蝦。試驗(yàn)幼魚由胚胎孵化培養(yǎng)1個(gè)月所得，其間喂食草履蟲和蛋黃營養(yǎng)液，注意清潔滅菌。

1.2 試驗(yàn)藥品

納米氧化銅（CuO NPs），購自美國Sigma公司，純度≥99%，平均粒徑為50～60 nm。間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222），購自Aladdin阿拉丁公司。斑馬魚三碘甲狀腺原氨酸（T3）和甲狀腺素（T4）ELISA檢測試劑盒，購自上海哈靈生物科技有限公司。DEPC、Trizol和cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購自Beyotime。SYBR Green熒光探針（BIO-RAD）。

1.3 甲狀腺濾泡病理切片

稱取1 mg的CuO NPs至200 mL去氯曝氧自來水，超聲30 min，制得母液。配制不同濃度梯度的CuO NPs（0、10、50、100 μg/L）懸浮液作為幼魚的養(yǎng)殖水。暴露容器為5 L大燒杯，每濃度設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行10條魚，每日定時(shí)更換全部養(yǎng)殖水。試驗(yàn)周期為20 d，暴露結(jié)束后，用200 mg/L的 MS-222 麻醉斑馬魚，切取下頜部位。采用蘇木-伊紅（HE）染色法制作甲狀腺濾泡的切片，具體過程：甲醛固定和流水沖洗;不同濃度乙醇脫水;二甲苯透明;浸蠟和包埋;切片、鋪片、烤片;二甲苯脫蠟和蘇木伊紅染色;脫水和封片。最后用正置光學(xué)顯微鏡（Nikon Eclipse E100）觀察切片結(jié)果，放大400倍，在成像系統(tǒng)（NIKON DS-U3）上采集圖像。

1.4 甲狀腺激素含量的測定

試驗(yàn)周期結(jié)束后，取整魚勻漿，取上清。采用雙抗一步夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELASA）法測定勻漿中T3和T4的含量。具體步驟：在96孔板中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中均加入100 μL相同濃度T3或T4抗體，封板膜密封反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育;2 h后洗板，即甩去反應(yīng)液，在吸水紙上拍干，每孔再加滿洗滌液，甩干拍板，重復(fù)3～5次;標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，待測樣本孔先加樣本（不同濃度組的斑馬魚勻漿上清）10 μL，再加樣本稀釋液40 μL（即樣本被稀釋5倍），空白孔則不加。溫育，重復(fù)上述洗滌過程。之后，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μL，溫育0.5 h;每孔加入 50 μL 顯色液，37 ℃避光孵育15～20 min;最后每孔加入50 μL硫酸，在450 nm波長處測定每孔的吸光度D值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，縱坐標(biāo)是對應(yīng)D值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得到實(shí)際樣本濃度。

1.5 代謝基因ugt1ab表達(dá)的定量分析

Trizol法提取整魚的總RNA，參照鄧?yán)虻鹊姆椒╗19]，cDNA反轉(zhuǎn)錄參照試劑盒說明書。本試驗(yàn)選用SYBR Green I作為DNA結(jié)合染料，β-actin作為內(nèi)參基因，引物設(shè)計(jì)主要參考Yu等的方法[20]，由Invitrogen公司合成。具體引物序列詳見表1，反應(yīng)體系詳見表2。擴(kuò)增程序設(shè)置：預(yù)變性95 ℃ 30 s;變性95 ℃ 5 s，退火58 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)樣本設(shè)置2個(gè)技術(shù)重復(fù)。本試驗(yàn)中采用Livak（2-ΔΔCT）法[21]確定不同樣本中目標(biāo)基因表達(dá)水平的相對差異。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS statistics 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理數(shù)據(jù)，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示結(jié)果，“*”表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異（P

2 結(jié)果與分析

2.1 CuO NPs對斑馬魚甲狀腺濾泡的影響

斑馬魚暴露在不同濃度的CuO NPs懸浮液中20 d后，由圖1可知，對照組（A）的甲狀腺濾泡由上皮細(xì)胞圍繞著充滿均勻膠質(zhì)的濾泡腔組成， 并且上皮細(xì)胞的細(xì)胞核形狀規(guī)則單一;10 μg/L組（B）的甲狀腺濾泡開始出現(xiàn)腔內(nèi)膠質(zhì)液體流失;50 μg/L組（C）的膠體流失更加明顯， 同時(shí)還伴有上皮細(xì)

胞增生現(xiàn)象;在高濃度100 μg/L組（D），除了膠質(zhì)液體減少、細(xì)胞增生，還出現(xiàn)細(xì)胞形狀變柱高狀和細(xì)胞核變肥大不規(guī)則。由此可見，CuO NPs對斑馬魚的甲狀腺濾泡造成膠體流失、上皮細(xì)胞增生、細(xì)胞形態(tài)改變和細(xì)胞核異常等損傷作用。

2.2 CuO NPs對斑馬魚T3水平的影響

斑馬魚暴露在不同濃度的CuO NPs懸浮液中20 d后，體內(nèi)的T3水平見圖2。隨著CuO NPs濃度的上升，T3含量也上升，呈現(xiàn)劑量的依賴性。對照組的T3含量為 3.2 ng/mL，各濃度組的T3含量均顯著高于對照組（P<0.05），分別上升了60.63%、81.88%和95.94%。

2.3 CuO NPs對斑馬魚T4水平的影響

由圖3可知，T4表達(dá)趨勢和T3相似。對照組的T4含量為12.87 ng/mL，根據(jù)差異顯著性分析，當(dāng)CuO NPs為50、100 μg/L 時(shí)，其T4含量顯著高于對照組（P

2.4 CuO NPs對代謝基因水平的影響

斑馬魚暴露在不同濃度的CuO NPs懸浮液中20 d后，參與激素代謝過程的基因ugt1ab表達(dá)趨勢見圖4。當(dāng)CuO NPs為50、100 μg/L時(shí)，其ugt1ab表達(dá)倍數(shù)顯著低于對照組（P<0.05），分別下調(diào)了0.29倍和0.83倍。

3 討論與結(jié)論

3.1 CuO NPs對斑馬魚甲狀腺濾泡的影響

一般而言，組織的病理變化可以直觀反應(yīng)外源物質(zhì)對機(jī)體的損傷狀況。魚類在接觸水體中一些污染物后，甲狀腺組織結(jié)構(gòu)會發(fā)生結(jié)構(gòu)性變化，主要包括濾泡上皮厚度增厚或變薄、上皮細(xì)胞肥大和增生、膠質(zhì)減少等。與其他硬骨魚類一樣，斑馬魚的甲狀腺是一個(gè)彌散在體內(nèi)的腺體，在咽喉部的鰓小動脈處可發(fā)現(xiàn)大量的甲狀腺濾泡[22]，所以本研究切取斑馬魚的下頜制作組織切片以觀察CuO NPs對甲狀腺濾泡機(jī)構(gòu)的影響。魚類的T4合成過程發(fā)生在甲狀腺濾泡的上皮細(xì)胞中，體內(nèi)T4水平與甲狀腺濾泡的結(jié)構(gòu)變化有直接的關(guān)聯(lián)。有研究表明，暴露在1 000 ng/L多氯聯(lián)苯（Aroclor 1254）下的褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼魚，各處理組中均出現(xiàn)甲狀腺濾泡個(gè)體變小、膠質(zhì)流失、上皮細(xì)胞增生等現(xiàn)象，由此推測，T4水平下降，可能與甲狀腺濾泡合成受到Aroclor 1254抑制有關(guān)[23]。在微囊藻毒素（MC-LR）對青年期的斑馬魚毒性試驗(yàn)中，暴露28 d后甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)肥大和增生。在暴露14 d時(shí)，25 g/L組的T4含量顯著上升，暴露21 d時(shí)，所有處理組的T4含量均顯著上升，由此可見，MC-LR刺激甲狀腺濾泡細(xì)胞增生，可能是誘導(dǎo)T4急劇合成的重要原因之一[24]。有人曾推測，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞變柱高狀，呈“細(xì)胞分裂”象，濾泡內(nèi)的膠體減少，可能是甲狀腺功能亢進(jìn)的體現(xiàn)[25]。

本研究切片結(jié)果顯示，甲狀腺濾泡中膠質(zhì)液體減少、上皮細(xì)胞增生和細(xì)胞形狀變柱高狀，這些現(xiàn)象又與T4水平的上升密切相關(guān)，由此推測，CuO NPs對斑馬魚甲狀腺的組織結(jié)構(gòu)造成病理損傷，可能進(jìn)一步加快了T4的合成速率。

3.2 CuO NPs對斑馬魚T3和T4的影響

由于T4不能直接發(fā)揮甲狀腺激素效應(yīng)，因此存在于靶器官中的脫碘酶能把T4脫碘轉(zhuǎn)化為生物活性更高、能夠參與正常生理活動的T3，維持T3和T4的平衡是動物進(jìn)行各種正常生理活動的基礎(chǔ)[26]。外源物質(zhì)對甲狀腺系統(tǒng)的干擾效應(yīng)，除了損傷腺體之外，最常見的是引起THs水平的變化。杜佳等研究表明，全氟辛烷磺酸鉀（PFOS）和納米氧化鋅（Nano-ZnO）的聯(lián)合暴露可增加斑馬魚幼魚體內(nèi)的T3含量，同時(shí)抑制體內(nèi)T4的含量[27]。Chang等將成年斑馬魚暴露于不同濃度的丁草胺中，結(jié)果顯示在暴露30 d后，100 μg/L組的T3和T4水平均出現(xiàn)顯著上升的趨勢[28]。

在本研究中，暴露在CuO NPs中的斑馬魚各處理組的T3、T4水平均呈現(xiàn)顯著性上升，并伴有劑量的依賴性，THs水平的變化可直接影響斑馬魚甲狀腺的正常生理活動。

3.3 CuO NPs對代謝基因的影響

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDPGT）主要分布在肝、腸道和腎等器官中，它能將機(jī)體內(nèi)的外來異物和內(nèi)源物質(zhì)及時(shí)代謝排出體外[29]。當(dāng)斑馬魚體內(nèi)產(chǎn)生過量的THs時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDPGT）為糖基供體與底物THs結(jié)合進(jìn)行葡萄糖苷化反應(yīng)，增強(qiáng)THs的水溶性，使其快速從膽汁、鰓和皮膚排出[26]。當(dāng)UDPGT活力降低時(shí)，會造成體內(nèi)的THs大量滯留。檢測斑馬魚UDPGT編碼基因ugt1ab表達(dá)水平，可以間接反應(yīng)出UDPGT的活力。在本研究結(jié)果中，10 μg/L組的ugt1ab表達(dá)輕微上調(diào)，50、100 μg/L組的表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，由此可見，CuO NPs影響激素代謝基因的表達(dá)，從而影響代謝酶的活力，所以斑馬魚體內(nèi)的甲狀腺激素不能及時(shí)代謝排出，導(dǎo)致幼魚體內(nèi)的T3和T4含量偏高。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，CuO NPs對斑馬魚甲狀腺系統(tǒng)的干擾效應(yīng)主要表現(xiàn)為甲狀腺濾泡的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，這可能與體內(nèi)甲狀腺激素偏高有關(guān)，而激素水平偏高與激素的代謝受到抑制有關(guān)。關(guān)于CuO NPs對魚類甲狀腺系統(tǒng)的具體干擾途徑可作進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bochenkov V E，Sergeev G B. Adsorption，catalysis，and reactions on the surfaces of metal nano-oxides[J]. Catalysis in Industry，2010，2（1）：1-10.

[2]Batley G E，Kirby J K，Mclaughlin M J. Fate and risks of nanomaterials in aquatic and terrestrial environments[J]. Accounts of Chemical Research，2013，46（3）：854-862.

[3]Borkow G，Zatcoff R C，Gabbay J. Reducing the risk of skin pathologies in diabetics by using copper impregnated socks[J]. Medical Hypotheses，2009，73（6）：883-886.

[4]Ahamed M，Siddiqui M A，Akhtar M J，et al. Genotoxic potential of copper oxide nanoparticles in human lung epithelial cells[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications，2010，396（2）：578-583.

[5]Zhao J，Wang Z，Liu X，et al. Distribution of CuO nanoparticles in juvenile carp （Cyprinus carpio） and their potential toxicity[J]. Journal of Hazardous Materials，2011，197（24）：304-310.

[6]Nair P M，Chung I M. Impact of copper oxide nanoparticles exposure on arabidopsis thaliana growth，root system development，root lignificaion，and molecular level changes[J]. Environmental Science and Pollution Research，2014，21（22）：12709-12722.

[7]Nair P M，Chung I M. Study on the correlation between copper oxide nanoparticles induced growth suppression and enhanced lignification in Indian mustard （Brassica juncea L.）[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2015，113：302-313.

[8]Ali S，Champagne D L，Spaink H P，et al. Zebrafish embryos and larvae：a new generation of disease models and drug screens[J]. Birth Defects Research Part C-Embryo Today-Reviews，2011，93（2）：115-133.

[9]He J H，Guo S Y，Zhu F，et al. A zebrafish phenotypic assay for assessing drug-induced hepatotoxicity[J]. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods，2013，67（1）：25-32.

[10]Zhu J J，Xu Y Q，He J H，et al. Human cardiotoxic drugs delivered by soaking and microinjection induce cardiovascular toxicity in zebrafish[J]. Journal of Applied Toxicology，2014，34（2）：139-148.

[11]陳汝家，朱俊靖，周盛梅，等. 斑馬魚模型在藥物毒性與安全性評價(jià)中的應(yīng)用[J]. 毒理學(xué)雜志，2012，26（3）：224-228.

[12]Ganesan S，Raghunath A，Vijayakumar S，et al. Acute and sub-lethal exposure to copper oxide nanoparticles causes oxidative stress and teratogenicity in zebrafish embryos[J]. Journal of Applied Toxicology，2015，36（4）：554-567.

[13]Sun Y，Zhang G，He Z Z，et al. Effects of copper oxide nanoparticles on developing zebrafish embryos and larvae[J]. International Journal of Nanomedicine，2016，11：905-918.

[14]Xu J，Zhang Q P，Li X，et al. The effects of copper oxide nanoparticles on dorsoventral patterning，convergent extension，and neural and cardiac development of zebrafish[J]. Aquatic Toxicology，2017，188：130-137.

[15]Krassas G E，Poppe K，Glinoer D. Thyroid function and human reproductive health[J]. Endocrine Reviews，2010，31（5）：702-755.

[16]Power D M，Llewellyn L，F(xiàn)austino M，et al. Thyroid hormones in growth and development of fish[J]. Comparative Biochemistry and Physiology（Toxicology & Pharmacology），2001，130（4）：447-459.

[17]Slanchev K，Stebler J，Cueva-Méndez G，et al. Development without germ cells：the role of the germ line in zebrafish sex differentiation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（11）：4074-4079.

[18]Siegfried K R，Nuesslein-Volhard C. Germ line control of female sex determination in zebrafish[J]. Developmental Biology，2008，324（2）：277-287.

[19]鄧 莉，馬春明，袁瓊蘭，等. 用TRIzol試劑抽提新生鼠腦組織總RNA[J]. 瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，28（6）：505-506.

[20]Yu L Q，Deng J，Shi X J，et al. Exposure to DE-71 alters thyroid hormone levels and gene transcription in the hypothalamic-pituitary-thyroid axis of zebrafish larvae[J]. Aquatic Toxicology，2010，97（3，SI）：226-233.

[21]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[22]Patino R，Wainscott M R，Cruz-Li E I，et al. Effects of ammonium perchlorate on the reproductive performance and thyroid follicle histology of zebrafish[J]. Environmental Toxicology and Chemistry，2003，22（5）：1115-1121.

[23]Dong Y F，Zhang X N，Tian H，et al. Effects of polychlorinated biphenyls on metamorphosis of a Marine fish Japanese flounder （Paralichthys olivaceus） in relation to thyroid disruption[J]. Marine Pollution Bulletin，2017，119（1）：325-331.

[24]Liu Z D，Tang R，Li D P，et al. Subacute microcystin-LR exposure alters the metabolism of thyroid hormones in juvenile zebrafish （Danio rerio）[J]. Toxins，2015，7（2）：337-352.

[25]Fournie J W，Wolfe M J，Wolf J C，et al. Diagnostic criteria for proliferative thyroid lesions in bony fishes[J]. Toxicologic Pathology，2005，33（5）：540-541.

[26]Jugan M L，Levi Y，Blondeau J P. Endocrine disruptors and thyroid hormone physiology[J]. Biochemical Pharmacology，2010，79（7）：939-947.

[27]杜 佳，王樹濤，尤 宏. 全氟辛烷基磺酸鉀（PFOS）和納米氧化鋅（Nano-ZnO）復(fù)合暴露對斑馬魚下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015，10（6）：144-153.

[28]Chang J H，Liu S Y，Zhou S L，et al. Effects of butachlor on reproduction and hormone levels in adult zebrafish （Danio rerio）[J]. Experimental and Toxicologic Pathology，2013，65（1/2）：205-209.

[29]郭 棟，龐良芳，周宏灝. 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性的研究進(jìn)展[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展，2010，41（2）：107-111.