尚泰宇，時春雨，秦朝輝，彭夢圓，賈博爽，夏曉華

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

稻田養(yǎng)魚亦即嵌套養(yǎng)殖，是一種人工稻魚共存的生態(tài)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)[1]。該農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式將養(yǎng)殖業(yè)與種植業(yè)結(jié)合起來，因其高效便捷、經(jīng)濟(jì)雙收等特點受到越來越多養(yǎng)殖戶的青睞。小型淡水魚類泥鰍(Misgurnusanguillicadatus)隸屬鯉形目、鰍科、泥鰍屬。其食性較廣，是稻田生態(tài)漁業(yè)的優(yōu)良養(yǎng)殖品種。同時，其具有環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)、耐受性強(qiáng)等特點，是理想的水生生物試驗材料。

氰氟草酯(Cyhalofop-butyl)作為一種對水稻具有高度安全性的芳氧苯氧丙酸類除草劑，在田間主要用于防除千金子等惡性禾本科雜草，近年來在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的使用呈逐步上升趨勢[2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化學(xué)除草劑的不合理使用，易導(dǎo)致其通過地表徑流、污水排放等方式流入河流、湖泊等水生生態(tài)系統(tǒng)，通過食物鏈富集，進(jìn)一步對水生生物的生存及人體健康構(gòu)成威脅。近年來，已有關(guān)于氰氟草酯對兩棲類生物毒性分級、斑馬魚胚胎發(fā)育等水生生物影響的報道。吳長興等[3]研究了氰氟草酯對澤蛙蝌蚪的急性毒性，結(jié)果顯示，其對澤蛙蝌蚪的24 h半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)和48 h LC50分別為0.718 mg/L和0.677 mg/L，屬高毒級，田間施用應(yīng)合理控制劑量；CAO等[4]研究了氰氟草酯對斑馬魚早期胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明，0.8 mg/L或更高質(zhì)量濃度的氰氟草酯溶液對于早期胚胎發(fā)育具有更明顯的致死效應(yīng)，同時氰氟草酯在斑馬魚胚胎發(fā)育的不同階段均產(chǎn)生較嚴(yán)重的負(fù)面影響。

目前，關(guān)于氰氟草酯對泥鰍的毒性研究尚未見報道。為此，以泥鰍為受試對象，探究了氰氟草酯對泥鰍肝臟的急性毒性、生理毒性及組織形態(tài)學(xué)毒性，旨在為安全施用氰氟草酯、促進(jìn)農(nóng)業(yè)特色生產(chǎn)結(jié)構(gòu)水稻-泥鰍嵌套養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展、維護(hù)生態(tài)平衡提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 供試動物及試劑

泥鰍(Misgurnusanguillicadatus)采自新鄉(xiāng)市海鴻農(nóng)貿(mào)市場，選擇發(fā)育狀況良好、體質(zhì)量13～16 g、平均體長9～12 cm的健壯泥鰍500尾，試驗前用曝氣3 d的自來水馴養(yǎng)7 d，馴養(yǎng)期間死亡率小于2%。挑選健康、體表無損的個體作為試驗材料；試驗前進(jìn)行饑餓處理，試驗期間不投食，采用曝氣2 d以上的自來水，水溫13～24 ℃，溶解氧5～6 mg/L，pH值6.8～7.3。氰氟草酯購自上?；莨饣瘜W(xué)有限公司(有效成分質(zhì)量濃度100 g/L)。

1.2 試驗方法

1.2.1 氰氟草酯對泥鰍的急性毒性試驗 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，等比設(shè)置5個試驗組和1個空白對照組進(jìn)行急性毒性試驗，氰氟草酯質(zhì)量濃度分別為6.00、6.30、6.62、6.95、7.29、0 mg/L，每組均投放健康泥鰍30尾，分為3個平行。每24 h更換一次等體積等質(zhì)量濃度的氰氟草酯，試驗開始后12 h連續(xù)觀察，記錄泥鰍24、48、72、96 h的中毒癥狀和死亡數(shù)量，及時清除死亡個體。最后，采用改良寇氏法[5-6]計算氰氟草酯對泥鰍的半數(shù)致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度(SC)。

1.2.2 氰氟草酯對泥鰍抗氧化系統(tǒng)酶活性的影響測定 在急性毒性試驗的基礎(chǔ)上，按照氰氟草酯處理96 h對泥鰍LC50的1/10、1/5分別設(shè)置低質(zhì)量濃度試驗組(0.662 4 mg/L)、高質(zhì)量濃度試驗組(1.324 8 mg/L)及1個空白對照組(0 mg/L)，每組均投放44尾健康泥鰍，每天更換一次等體積等質(zhì)量濃度的氰氟草酯。分別于第1、3、5、7天從每組隨機(jī)取5尾泥鰍，取其肝臟，在試驗過程中，首先稱量泥鰍肝臟的質(zhì)量，然后以1∶9的比例加入0.8%生理鹽水進(jìn)行研磨直至無明顯的組織塊，SOD、CAT、GSH-Px活性的測定均按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進(jìn)行，采用BCA法測定泥鰍肝臟蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 氰氟草酯對泥鰍抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響測定 處理組和取材天數(shù)同上，從每組隨機(jī)取3尾泥鰍，取其肝臟保存于液氮。首先進(jìn)行總RNA的提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗總RNA完整性，超微量分光光度計檢測RNA的純度和質(zhì)量濃度。使用全氏金RNA提取試劑盒構(gòu)建20 μL反轉(zhuǎn)錄體系，其中包括Anchored Oligo(dT)181 μL、2×ES Reaction Mix 10 μL、EasyScript RT/R1 Enzyme Mix 1 μL、mRNA/總RNA 500 ng/μg，添加RNase-free Water至20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件:42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 s失活EasyScript RT/R1，4 ℃保溫，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取cDNA 0.5 μL為模板，相應(yīng)基因正向和反向引物(表1)各0.2 μL，含有SYBR Green Ⅰ熒光染料、dNTPs、PCR增強(qiáng)劑、PCR穩(wěn)定劑的混合物5 μL和ddH2O 4.1 μL構(gòu)建10 μL實時熒光定量PCR(qPCR)反應(yīng)體系，重復(fù)6組。qPCR擴(kuò)增的參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性15 s 和60 ℃復(fù)性60 s共進(jìn)行45個循環(huán)；之后95 ℃ 10 s、65 ℃ 60 s、97 ℃ 1 s、37 ℃保溫30 s。測定出各個基因的Ct值，根據(jù)2-△△Ct法計算相關(guān)基因表達(dá)量。

表1 定量PCR引物信息

1.2.4 氰氟草酯對泥鰍的組織形態(tài)學(xué)毒性試驗 處理和取材時間同酶活性測定，從每組隨機(jī)取3尾泥鰍，取其肝臟進(jìn)行石蠟切片HE染色。試驗前配制鉻礬明膠，清洗玻片，熬融石蠟。取泥鰍肝臟于4%多聚甲醛中固定24 h，流水沖洗后依次進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟試驗步驟，最后用牛皮盒紙進(jìn)行包埋。完成包埋的組織依次進(jìn)行切片、展片、烤片、二甲苯浸泡、梯度酒精復(fù)水處理，最后對石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡觀察其組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

肝臟組織酶活性和基因表達(dá)試驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2010軟件進(jìn)行處理和分析，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異達(dá)到顯著水平，P<0.01為差異達(dá)到極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 氰氟草酯對泥鰍的急性毒性

泥鰍剛?cè)径緯r，表現(xiàn)為急劇游動、四處亂竄，片刻后稍趨于平靜，伏于水底。隨著氰氟草酯劑量的增加，可觀察到泥鰍反應(yīng)遲鈍、身體彎曲、喪失平衡能力等現(xiàn)象，其死亡率不斷升高，死亡時身體僵直，脊椎略彎曲呈弓形。

由表2可知，氰氟草酯對泥鰍24、48、72、96 h的LC50分別為7.254 4、7.102 3、6.809 3、6.623 7 mg/L，SC為2.042 3 mg/L。在同一時間段內(nèi)，泥鰍死亡率隨氰氟草酯質(zhì)量濃度的升高而增加；在同一劑量組中，泥鰍死亡率隨暴露時間的延長而增加?？梢?，泥鰍的死亡率與氰氟草酯呈時間-劑量效應(yīng)關(guān)系。

表2 氰氟草酯各質(zhì)量濃度組泥鰍的死亡率、半數(shù)致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度

2.2 氰氟草酯對泥鰍肝臟SOD、CAT和GSH-Px活性的影響

由圖1可知，從相同質(zhì)量濃度不同暴露時間來看，在低質(zhì)量濃度組，泥鰍肝臟SOD活性在第3天升高后無顯著性變化(P>0.05)，高質(zhì)量濃度組SOD活性在第5天下降后無顯著性變化(P>0.05)，且試驗組SOD活性均顯著高于對照組(P<0.05)。隨著染毒時間的延長，試驗組中CAT活性逐漸下降，且高質(zhì)量濃度組較低質(zhì)量濃度組變化更顯著。GSH-Px活性呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，低質(zhì)量濃度組中GSH-Px活性在第5天達(dá)最大值，高質(zhì)量濃度組中GSH-Px活性在第3天達(dá)最大值。

從相同暴露時間不同質(zhì)量濃度組來看，在第1、3天，SOD活性隨氰氟草酯質(zhì)量濃度的增大而升高，在第5、7天，SOD活性先升高后降低，處理組均顯著高于對照組(P<0.05)。在第1天，CAT活性隨氰氟草酯質(zhì)量濃度的增大而升高，而在第3、5、7天均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，至第7天時處理組與對照組無顯著差異。在第1、3天，GSH-Px活性隨氰氟草酯質(zhì)量濃度的增大而升高，在第5、7天呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

不同小寫字母表示同一劑量組不同暴露時間點之間存在顯著性差異(P<0.05)，不同大寫字母表示同一暴露時間點不同劑量組之間存在顯著性差異(P<0.05)，下同

2.3 氰氟草酯對泥鰍肝臟SOD、CAT、GSH-Px基因表達(dá)的影響

由圖2可知，從相同質(zhì)量濃度不同暴露時間來看，在低質(zhì)量濃度組中，SOD和CAT基因表達(dá)量隨暴露時間的延長而呈上升趨勢，GSH-Px基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。高質(zhì)量濃度組中，SOD和CAT基因表達(dá)量隨暴露時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，GSH-Px基因表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢。

從相同暴露時間不同質(zhì)量濃度組來看，隨著氰氟草酯質(zhì)量濃度的升高，在第1、3天，SOD基因表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，而在第5、7天呈現(xiàn)先上升后下降趨勢；在第1天，CAT基因表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，在第3、5、7天均呈先上升后下降趨勢；在第1天，GSH-Px基因表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，在第3、5、7天則呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，同時在低質(zhì)量濃度組及高質(zhì)量濃度組的基因表達(dá)量均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖2 不同質(zhì)量濃度氰氟草酯處理泥鰍肝臟中SOD、CAT、GSH-Px基因表達(dá)變化Fig.2 Expression changes of SOD, CAT and GSH-Px genes in Misgurnus anguillicaudatus liver treated with cyhalofop-butyl at different concentrations

2.4 氰氟草酯對泥鰍肝臟組織形態(tài)的影響

由圖3可知，空白對照組(0 mg/L)中，泥鰍的肝臟細(xì)胞胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核均位于細(xì)胞中央，呈規(guī)則圓形或橢圓形，肝臟細(xì)胞形態(tài)規(guī)則且無明顯變化。在低質(zhì)量濃度試驗組(0.662 4 mg/L)中，5 d時可見細(xì)胞間隙變大，7 d時可見細(xì)胞空泡化與細(xì)胞腫大現(xiàn)象。在高質(zhì)量濃度試驗組(1.324 8 mg/L)中，1 d時即可見肝臟細(xì)胞空泡化、細(xì)胞間隙增大現(xiàn)象，隨著染毒時間的延長，細(xì)胞腫大、空泡化情況嚴(yán)重；7 d時肝臟細(xì)胞排列彌散，出現(xiàn)大量肝臟細(xì)胞空泡，同時伴有細(xì)胞溶解及核變形現(xiàn)象，核固縮情況嚴(yán)重。結(jié)果表明，隨染毒天數(shù)和試驗組質(zhì)量濃度的增加，氰氟草酯對泥鰍肝臟組織損傷程度加深。

CS:細(xì)胞間隙;CV:細(xì)胞空泡;CE:細(xì)胞腫大;CP:細(xì)胞核固縮

3 結(jié)論與討論

3.1 氰氟草酯的毒性分類

根據(jù)中國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》，當(dāng)農(nóng)藥對魚類1.0 mg/L<96 h LC50≤10 mg/L時，該農(nóng)藥屬中毒[7]。由試驗結(jié)果可知，氰氟草酯對泥鰍的96 h LC50為6.623 7 mg/L，說明氰氟草酯對泥鰍屬于中毒。同時隨著染毒時間的延長，泥鰍死亡率逐漸升高，表明氰氟草酯對水生生物有毒害作用。因此，在使用該除草劑時應(yīng)注意合理使用，避免污染水源、破壞環(huán)境，以免對水生生物造成危害。

3.2 氰氟草酯對泥鰍肝臟抗氧化系統(tǒng)的影響

生物體肝臟在代謝有毒物質(zhì)時會產(chǎn)生大量的活性氧，如超氧自由基、過氧化氫等。這些活性氧會破壞生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA堿基、脂膜等物質(zhì)，從而造成生物體的損傷甚至死亡?？寡趸赶到y(tǒng)的主要作用是平衡生物體內(nèi)活性氧，避免其對生物體的氧化損傷[8]。已有研究表明，SOD、CAT、GSH-Px是生物防御體系的關(guān)鍵酶[9]。SOD能將生物體內(nèi)過多的超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和H2O，降低其毒性[10]。CAT能催化H2O2分解成H2O和O2，從而使細(xì)胞免受H2O2的毒害。GSH-Px能特異性催化GSH對脂質(zhì)氫過氧化物的還原作用，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。由于抗氧化酶對氧化脅迫敏感，故常作為研究機(jī)體是否處于氧化脅迫狀態(tài)的生物指標(biāo)。

本試驗中，在氰氟草酯低質(zhì)量濃度處理組中，泥鰍肝臟中SOD基因表達(dá)量呈上升趨勢，酶活性則呈先升高后降低趨勢；在高質(zhì)量濃度處理組中，SOD基因表達(dá)量呈先上升后下降趨勢，酶活性呈降低趨勢，推測高質(zhì)量濃度的氰氟草酯對SOD及其相關(guān)基因的影響呈先誘導(dǎo)后抑制作用。低質(zhì)量濃度處理組中，CAT基因表達(dá)量呈上升趨勢；在高質(zhì)量濃度處理組中，CAT基因表達(dá)量呈先上升后下降趨勢，可知高質(zhì)量濃度組中，細(xì)胞受到氧化脅迫較為嚴(yán)重；在各質(zhì)量濃度處理組中，CAT活性均呈下降趨勢，與張靜靜[11]有關(guān)甲氰菊酯對泥鰍肝臟CAT的毒性作用試驗結(jié)論一致。GSH-Px基因表達(dá)量及酶活性在低質(zhì)量濃度組中均呈先升高后降低的趨勢，在高質(zhì)量濃度組中，基因表達(dá)量呈下降趨勢，酶活性呈先升高后降低趨勢，推測氰氟草酯對GSH-Px基因的影響也呈先誘導(dǎo)后抑制作用。由以上結(jié)果推測，低質(zhì)量濃度的氰氟草酯能夠在短時間內(nèi)對泥鰍抗氧化酶系統(tǒng)的表達(dá)起誘導(dǎo)作用，這有助于機(jī)體快速代謝有毒物質(zhì)；而隨著暴露時間的延長和氰氟草酯劑量的增加，泥鰍肝臟組織發(fā)生病變，抗氧化酶系統(tǒng)持續(xù)受損，進(jìn)一步導(dǎo)致酶活及相關(guān)基因表達(dá)受到抑制。

3.3 氰氟草酯對泥鰍肝臟組織的損傷

魚類肝臟組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化通?？梢宰鳛榄h(huán)境中有毒污染物的生物指標(biāo)[12]。研究報道，當(dāng)魚類暴露于污染物中，會誘導(dǎo)產(chǎn)生肝臟細(xì)胞核裸露、胞質(zhì)空泡化現(xiàn)象，同時伴隨肝臟巨噬細(xì)胞增多、肝臟竇間隙增大等現(xiàn)象[13]。由于竇間隙的增大，肝臟細(xì)胞與血液間物質(zhì)交換發(fā)生變化，造成大量液體滯留而導(dǎo)致肝臟組織易發(fā)生水腫[14-15]。在本試驗中，低質(zhì)量濃度氰氟草酯處理泥鰍第5天時可見肝臟竇間隙變大，第7天時開始出現(xiàn)肝臟細(xì)胞空泡化及肝臟組織水腫現(xiàn)象，與之前研究報道相一致。高質(zhì)量濃度組中第7天可觀察到肝臟細(xì)胞空泡化、細(xì)胞腫大情況十分嚴(yán)重，并伴有核固縮現(xiàn)象，推測DNA停止轉(zhuǎn)錄，這是細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)特征之一[16]，說明氰氟草酯不僅使泥鰍的肝臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，還會導(dǎo)致肝臟細(xì)胞凋亡。

氰氟草酯對泥鰍有一定的急性毒性、生理毒性和組織損傷作用，因此在稻田施用時一定要控制其用量，防止水體污染，以減少對生態(tài)環(huán)境和稻田中的水生生物的危害，避免造成農(nóng)戶經(jīng)濟(jì)損失。合理施用農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的關(guān)鍵，對環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。