吳 鵬，魏 盼，李戀曲，王曉鈺，賈志榮，洪 敏

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046)

近幾十年來(lái)，世界范圍內(nèi)的過(guò)敏性疾病發(fā)病率急劇升高。變應(yīng)性接觸性皮炎是最常見(jiàn)的過(guò)敏性疾病之一，是一種多基因病，34%以上的歐洲人口都受其侵?jǐn)_[1-2]。變應(yīng)性接觸性皮炎是一種由半抗原致敏引起的抗原特異性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚炎性疾病，主要表癥為局部瘙癢、紅疹、水腫等，病癥持久且反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3-4]。

桂枝湯首載與《傷寒論》，組方有五味，即桂枝、白芍、甘草、生姜、大棗，是調(diào)和營(yíng)衛(wèi)的首選方。桂枝湯臨床上常用于治療過(guò)敏性皮炎、哮喘、關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病[5-6]。淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)程中直接的效應(yīng)細(xì)胞。過(guò)敏性疾病主要由2型免疫反應(yīng)介導(dǎo)，2型輔助T細(xì)胞(type 2 T help cells)在其中發(fā)揮重要作用[7-8]。已有研究表明，桂枝湯具有抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖的作用[9]。桂枝湯是否通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞向Th2型細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而治療過(guò)敏性疾病？基于此，本研究利用異硫氰酸熒光素(FITC)誘導(dǎo)的變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠模型，探討桂枝湯對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎模型的影響；并在體外提取小鼠的脾淋巴細(xì)胞，探討桂枝湯是否影響淋巴細(xì)胞分化。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠，SPF級(jí)，♂，4～6周齡，體質(zhì)量(18～22) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司南京分公司，合格證證號(hào)：SYXK(蘇)2014-0004。ICR小鼠，SPF級(jí)，♂，4～6周齡，體質(zhì)量(18～22) g，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，合格證號(hào)：SYXK(蘇)2017-0001。

1.2 藥物與試劑桂枝(批號(hào)20170601)為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝，白芍(批號(hào)20170601)為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall的干燥根，甘草(批號(hào)20171115)為豆科植物Glycyrrhizauralensis的干燥根和根莖，大棗(批號(hào)20170601)為鼠李科植物棗Ziziphusjujuba的干燥成熟果實(shí)，以上4味藥均購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)百草堂中醫(yī)門(mén)診部。生姜為姜科植物姜Zingiberofficinale的新鮮根莖，購(gòu)自南大和園農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。所有藥物均由南京中醫(yī)藥大學(xué)谷巍教授鑒定，符合2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定。丙酮(批號(hào)：20120803)、鄰苯二甲酸二丁酯(批號(hào)：20130829)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；FITC(批號(hào)：100125)，Sigma公司；小鼠IL-4 ELISA試劑盒(批號(hào)：E09338-1631)、IL-5 ELISA試劑盒(批號(hào)：4277363)、IL-9 ELISA試劑盒(批號(hào)：E16520-112)、IFNγ ELISA試劑盒(批號(hào)：4308729)、IgE ELISA試劑盒(批號(hào)：123956012)、IL-10 ELISA試劑盒(批號(hào)：4315167)，均購(gòu)自美國(guó)eBioscience；地塞米松注射液(批號(hào)：1512072111)，辰星藥業(yè)股份有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清，CAPRICORN SCIENTIFIC；刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)，Solarbio，批號(hào)：927G032；TRIzol(批號(hào)：7E191L7)、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(批號(hào)：7E140L7)、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(批號(hào)：7E181G7)，均購(gòu)自Vazyme。

1.3 儀器SI403電子天平、BSA423S-CW分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；7301測(cè)厚規(guī)(日本mitutoyo)；SyneRgy 2酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek)；GS-15R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN)；BX43倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；MCO-20AIC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋)；ABI7500 PCR儀(Applied Biosystems)。

2 方法

2.1 藥物制備桂枝湯處方如下：桂枝9 g、芍藥9 g、甘草6 g、生姜9 g、大棗18 g。按配齊藥物561 g，水煎2次合并煎液，減壓濃縮至2.24 kg·L-1。

2.2 變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠模型

2.2.1建立變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠模型 BALB/c小鼠在d 0腹部剔毛(3 cm×3 cm)，d1、2腹部涂抹80 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5% FITC溶液進(jìn)行致敏，d 6向小鼠右耳涂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6% FITC溶液20 μL進(jìn)行激發(fā)，對(duì)照組涂等體積的溶劑[鄰苯二甲酸二丁酯(V)∶丙酮(V)=1∶1]。24 h后，測(cè)量小鼠左右耳的厚度，計(jì)算耳腫脹度(耳腫脹度=右耳耳厚-左耳耳厚)；用8 mm直徑的打孔器在左右耳同一位置敲取耳圓片，稱(chēng)重，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2分組和給藥 將小鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松3.35×10-4g·kg-1)、桂枝湯組(2.21、6.63 g·kg-1)，每組6只。每天給藥1次，連續(xù)7 d，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射，桂枝湯組灌胃給藥，空白組以及模型組灌胃給予相同體積的生理鹽水。

2.2.3小鼠耳組織病理學(xué)檢查 激發(fā)24 h后，取小鼠右耳耳廓，于福爾馬林液中固定。固定后，進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，于BX43倒置顯微鏡下采集圖像。

2.2.4耳組織勻漿制備和ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá) 圓耳片精密稱(chēng)重后，用預(yù)冷的PBS制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的勻漿，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清液保存于-20 ℃，待測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)耳組織勻漿中的細(xì)胞因子。

2.3 脾淋巴細(xì)胞Th1/Th2分化

2.3.1小鼠脾淋巴細(xì)胞的提取和培養(yǎng) ICR小鼠脫頸椎處死，浸泡于75%的乙醇中10 min；取小鼠脾臟，用D-Hank′s沖洗兩遍；在盛有8 mL D-Hank′s的培養(yǎng)皿中，用玻璃注射器針芯研磨脾臟；經(jīng)200目濾布過(guò)濾細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中；1 500 r·min-1離心3 min，棄上清，加紅細(xì)胞裂解液3 mL重懸，室溫靜置3 min；加入D-Hank′s 5 mL，1 500 r·min-1離心3 min，棄上清液；加入8 mL D-Hank′s重懸細(xì)胞，1 500 r·min-1離心3 min；重復(fù)兩次后，加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基3 mL重懸細(xì)胞，并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×109·L-1，檢測(cè)細(xì)胞存活率>95%，置于冰上備用。

2.3.2細(xì)胞增殖的檢測(cè) 將小鼠脾淋巴細(xì)胞分為8組，分別為空白組和桂枝湯各劑量組(0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 mg·L-1)，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。桂枝湯各劑量組加入對(duì)應(yīng)劑量藥液，空白組加入同體積的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，1 000 r·min-1離心3 min，小心吸去上清，每孔加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL以及MTT溶液(5 mg·L-1) 10 μL。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入三聯(lián)液100 μL，于37 ℃烘箱中孵育過(guò)夜。次日在490 nm處檢測(cè)OD值，根據(jù)OD值判斷桂枝湯對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。

2.3.3細(xì)胞分組和給藥 將小鼠脾淋巴細(xì)胞分為5組，分別為空白組、ConA組(5 mg·L-1)、桂枝湯各劑量組(1、10、100 mg·L-1)，每組3個(gè)復(fù)孔，于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。模型組和桂枝湯各劑量組分別加入預(yù)先配好的含有ConA和桂枝湯的藥液，空白組加入同體積的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。48 h后，收集上清液，-20 ℃保存，待測(cè)，底部細(xì)胞加PBS 1 mL，待提RNA。

2.3.4檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-4、IL-10、IFNγ水平 按照ELISA說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-10、IFNγ水平。

2.3.5檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞中IL-4、IL-10、IFNγ、GATA3、T-bet基因的表達(dá)水平 離心管底部細(xì)胞加入1 mL PBS重懸，轉(zhuǎn)移至1.5 mL去酶EP管中，1 000 r·min-1離心3 min。棄上清，加0.5 mL TRIzol試劑提取RNA，冰上靜置5 min；加入氯仿100 μL，震蕩20 s，冰上靜置15 min；4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；將上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至新去酶EP管中，加入異丙醇0.5 mL，混勻，冰上靜置10 min；4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min；棄上清，每管加入75%乙醇50 μL，清洗RNA，冰上靜置10 min；4 ℃、7 500 r·min-1離心5 min；吸去乙醇，置于冰上揮干乙醇；加DEPC水20 μL，溶解RNA；檢測(cè)RNA的純度和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，再按照PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。各基因引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primer sequence of genes

Tab 2 Effects of GZD on levels of IL-4, IL-5 and IL-9 in ear homogenates of ACD mice

3 結(jié)果

3.1 桂枝湯對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎的影響

3.1.1桂枝湯對(duì)耳腫脹度的影響 如Fig 1所示，與空白組相比，模型組的耳腫脹度明顯升高；與模型組相比，桂枝湯2.21、6.63 g·kg-1組能明顯降低模型小鼠的耳腫脹度，桂枝湯6.63 g·kg-1還能明顯下降小鼠的耳厚差。

3.1.2桂枝湯對(duì)耳組織病理學(xué)的影響 如Fig 2所示，相較于空白組，模型組小鼠耳組織明顯增厚，存在大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織水腫。與模型組相比，桂枝湯2.21、6.63 g·kg-1組耳組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，耳腫脹程度明顯減輕。

3.1.3桂枝湯對(duì)耳組織勻漿中Th2型細(xì)胞因子的影響 Tab 2結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠耳組織勻漿中的Th2型炎癥因子IL-4、IL-5、IL-9水平明顯上升；與模型組相比，桂枝湯組小鼠耳組織勻漿中IL-4和IL-9水平明顯下降；但對(duì)IL-5的水平未見(jiàn)明顯影響。

3.1.4桂枝湯對(duì)耳組織勻漿中IFNγ以及血清中IgE的影響 如Fig 3所示，與空白組相比，模型組小鼠耳勻漿中IFNγ以及血清中IgE的水平明顯升高，給予桂枝湯能明顯抑制IFNγ和IgE的表達(dá)水平。

3.2 桂枝湯對(duì)脾淋巴細(xì)胞分化的影響

3.2.1桂枝湯對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測(cè)桂枝湯對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，F(xiàn)ig 4結(jié)果顯示，桂枝湯對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。

Fig 1 Effects of GZD on ear swelling(A)and ear weight(B) of ACD mice

3.2.2桂枝湯對(duì)ConA刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌Th2和Th1型細(xì)胞因子的影響 Tab 3結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組上清中IL-4和IL-10的水平明顯升高。桂枝湯各劑量能明顯抑制IL-4和IL-10的表達(dá)。與空白組相比，模型組脾淋巴細(xì)胞分泌IFNγ水平明顯升高，桂枝湯10、100 mg·L-1能明顯抑制IFNγ的表達(dá)。

Fig 2 Effect of GZD on histopathology of ear tissues of mice(HE×200)

Fig 3 Effects of GZD on IFNγ(A) in ear homogenates and IgE(B) in serum

3.2.3桂枝湯對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞中Th2和Th1相關(guān)基因表達(dá)的影響 Tab 4結(jié)果顯示，在ConA刺激下，模型組細(xì)胞中Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10以及Th2細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子GATA3基因的表達(dá)明顯升高，但桂枝湯各劑量均能明顯抑制IL-4、IL-10及GATA3基因的表達(dá)水平。在ConA刺激下，模型組細(xì)胞中Th1細(xì)胞因子IFNγ以及Th1細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子T-bet的基因表達(dá)水平明顯升高，桂枝湯各劑量能明顯降低IFNγ的基因表達(dá)水平，對(duì)T-bet的基因表達(dá)水平也有一定程度的下降作用。

4 討論

過(guò)敏性疾病是機(jī)體對(duì)抗外來(lái)抗原，產(chǎn)生異常免疫反應(yīng)所引起的疾病，過(guò)敏性疾病過(guò)程中以2型免疫反應(yīng)占主導(dǎo)作用，而Th2細(xì)胞就是許多過(guò)敏性疾病發(fā)病的核心[10]。T細(xì)胞分化為T(mén)h2細(xì)胞是由Th2特征性轉(zhuǎn)錄因子GATA3所調(diào)控的[11]。GATA3能促進(jìn)IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13等2型炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而促進(jìn)2型細(xì)胞因子的分泌，引起機(jī)體的2型免疫癥狀[12]。除了2型免疫反應(yīng)，1型免疫反應(yīng)在過(guò)敏性疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中也有重要作用。哮喘患者[13]以及過(guò)敏性皮炎小鼠[14]體內(nèi)，IFNγ表達(dá)水平較高。且研究表明，IFNγ與重度哮喘患者和小鼠的氣道高反應(yīng)有關(guān)[13]。

中醫(yī)認(rèn)為，過(guò)敏性疾病是屬于內(nèi)外共同發(fā)作的疾病，該病主要是由于正氣內(nèi)虛，營(yíng)衛(wèi)不和。因此，中醫(yī)認(rèn)為，該病的治療不能只緩解其臨床癥狀，還應(yīng)當(dāng)調(diào)理患者失和之營(yíng)衛(wèi)。桂枝湯首載于《傷寒論》，能調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，燮理陰陽(yáng)，歷代醫(yī)家稱(chēng)此方為仲景“群方之冠”。臨床應(yīng)用顯示，桂枝湯能明顯改善過(guò)敏性鼻炎、哮喘等患者的發(fā)病癥狀，并減少疾病的復(fù)發(fā)。本研究采用FITC誘導(dǎo)的變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠模型，探究桂枝湯治療過(guò)敏性疾病的作用。FITC是一種半抗原，其所引起的是一種2型免疫反應(yīng)[15]。結(jié)果顯示，給予桂枝湯能明顯降低模型小鼠的耳腫脹度，緩解耳組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并且還能降低IL-4、IL-9、IFNγ、IgE的水平，明確提示了桂枝湯對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎的治療作用。

為進(jìn)一步探討桂枝湯抑制2型免疫反應(yīng)的作用機(jī)制，研究探索了桂枝湯對(duì)Th2型淋巴細(xì)胞的影響，這類(lèi)細(xì)胞直接介導(dǎo)2型免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，桂枝湯能明顯降低脾淋巴細(xì)胞中Th2型特征性轉(zhuǎn)錄因子GATA3基因以及IL-4、IL-10的水平。此外，桂枝湯還能抑制IFNγ的表達(dá)，但對(duì)Th1細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)并無(wú)明顯影響。提示桂枝湯對(duì)脾淋巴細(xì)胞向Th2型分化具有抑制作用，同時(shí)也能一定程度上抑制Th1細(xì)胞，從而緩解2型免疫反應(yīng)癥狀。這可能是桂枝湯治療過(guò)敏性疾病的機(jī)制，值得進(jìn)一步探討。

Tab 3 Effects of GZD on expression of IL-4, IL-10 and IFNγ in splenic lymphocytes stimulated by ConA

Tab 4 Effects of GZD on gene expression of Th2 and Th1 associated factors in splenic lymphocytes stimulated by ConA

Fig 4 Effect of GZD on proliferation of splenic lymphocytes