陳美娟，蔣日磊，胡 澄，程子昱，路悅陽(yáng)，李祺瑞，顧 玲，李紅曉，張 旭

(南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

腫瘤轉(zhuǎn)移是臨床上導(dǎo)致癌癥病人死亡的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)信號(hào)來(lái)源于癌細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境細(xì)胞分子之間的相互作用，包括腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等。其中，腫瘤細(xì)胞與血小板的相互作用既存在于腫瘤微環(huán)境，也存在于血液環(huán)境或腹水中，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[1]。臨床超過(guò)30%的惡性實(shí)體瘤病人中都存在血小板增多癥[2]。血小板數(shù)量和聚集程度的明顯提高不僅促進(jìn)肺癌的血行轉(zhuǎn)移[3]，還是造成肺癌病人靜脈栓塞的重要原因[4-5]。“周氏克金巖方”(簡(jiǎn)稱克方)為國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授的臨床肺癌治療驗(yàn)方。前期研究表明，其具有較好的抑瘤作用，同時(shí)對(duì)小鼠生存期及生存質(zhì)量具有明顯的改善作用[6]。本研究擬揭示該方對(duì)Lewis肺癌小鼠模型凝血功能的影響。

1 材料與方法

Tab 1 Effects of Ke formula on plasma coagulation parameters in Lewis lung cancer bearing mice

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株 清潔級(jí)C57BL/6小鼠36只，♂，體質(zhì)量(18～22) g，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(蘇)2014-0001。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(Lewis lung cancer cell line, LLC)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2藥物 周氏克金巖方(冬瓜子15 g、膽南星12 g、魚腥草15 g、金蕎麥15 g、山慈菇10 g、金銀花15 g、紅花10 g、蘇木10 g、半夏10 g、貓爪草15 g、南沙參12 g、麥冬12 g、玉竹12 g)，由南京中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室按常規(guī)方法煎制成浸膏，稀釋至所需濃度[7]。

1.1.3試劑 胎牛血清、RMPI 1640培養(yǎng)液，Gibco公司；凝血指標(biāo)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自Sekisui Medical Co., LTD。

1.1.4儀器 CP3000全自動(dòng)凝血分析儀(日本積水醫(yī)療科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) LLC細(xì)胞株使用含10%胎牛血清的RPMI 1640(青霉素100 kU·L-1、鏈霉素100 kU·L-1，pH 7.2)培養(yǎng)液，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2動(dòng)物模型的建立 取6～8周的健康C57BL/6小鼠，25 ℃恒溫條件飼養(yǎng)。將體外培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌LLC細(xì)胞按1×1010·L-1的濃度，取0.2 mL注射入小鼠右上肢皮下，待瘤生長(zhǎng)到3～5 mm，則造模成功，具體方法同文獻(xiàn)[6]。

1.2.3分組及給藥方法 造模成功小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分為正常組(Normal)、模型組(Model)、阿司匹林(19.5 mg·kg-1)組、周氏克金巖方低、中、高劑量(Ke 0.95、1.9、3.8 mg·kg-1)組，每組6只，灌胃給藥15 d。

1.2.4凝血指標(biāo)檢測(cè) 將標(biāo)本上全自動(dòng)血凝儀檢測(cè)，采血后4 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間兩兩比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 周氏克金巖方對(duì)Lewis肺癌小鼠抗凝血相關(guān)指標(biāo)的影響如Tab 1所示，相對(duì)于造模組，阿司匹林組明顯延長(zhǎng)了活化部分凝血酶原時(shí)間(APTT)值(P<0.05)，同時(shí)給藥高劑量組也明顯延長(zhǎng)了APTT時(shí)間(P<0.05)；相對(duì)于造模組，阿司匹林組明顯延長(zhǎng)了造模后凝血酶時(shí)間(TT)水平(P<0.05)，給藥高劑量組同樣明顯延長(zhǎng)了TT水平(P<0.05)。

2.2 周氏克金巖方對(duì)Lewis肺癌小鼠促凝血相關(guān)指標(biāo)的影響如Tab 1所示，造模組明顯升高了纖維蛋白原(FIB)的水平(P<0.05)，而給藥中劑量組則明顯降低了FIB的水平(P<0.05)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，在接種Lewis肺癌移植瘤后，小鼠的抗凝血指標(biāo)中凝血酶原時(shí)間(PT)及TT的值相對(duì)于正常組均有所降低，表現(xiàn)出高凝特征，阿司匹林給藥明顯延長(zhǎng)了APTT及TT水平。同樣，在高劑量的周氏克金巖方給藥后，也明顯延長(zhǎng)了APTT及TT的水平，顯示出該復(fù)方抗凝血的藥效作用。而對(duì)于促凝血指標(biāo)，造模組FIB的水平相對(duì)于模型組明顯升高，而周氏克金巖方中劑量給藥組則明顯降低FIB的值。結(jié)果表明，周氏克金巖方中、高劑量給藥對(duì)于肺癌模型的高凝血特征有明顯的改善作用。