張先成 李晶 曹旭 姜威 胡基華 孟利強

摘要 開展了污泥堆肥中功能菌株篩選的研究，分別以污泥堆肥物料中的各種大分子有機物為目標底物，篩選各自的降解菌株，通過初篩和復篩（酶活性強弱）選擇最佳功能菌株，優(yōu)化組合獲得污泥堆肥的功能復合菌群。該研究可為污泥堆肥的功能菌株優(yōu)選及其工藝優(yōu)化提供理論依據和技術支持。

關鍵詞 污泥堆肥;功能菌群;分離篩選;酶活

中圖分類號 S141.4文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0078-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.022

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract In this study， functional strains in sludge sludge composting were screened. The various organic macromolecules of sludge composting materials were used as the target substrates to screen degradation strains. The best functional strains were obtained by the preliminary screening and secondary screening， then were assembled into a functional bacteria community. This work would provide theoretical basis and technical support for screening functional strains in sewage sludge composting and their process optimization.

Key words Sewage sludge composting;Functional bacteria community;Separation and screening;Enzyme activity

基金項目 國家自然科學青年基金項目（51708187）;黑龍江省科學院科學基金項目（wsw6840228）;黑龍江省科學院杰出青年基金項目（CXJJ2018SW01）。

作者簡介 張先成（1984—），男，黑龍江伊春人，高級工程師，碩士，從事微生物學、基因工程研究。*通信作者，副研究員，碩士，從事生物技術、固體廢棄物資源化處理等研究。

收稿日期 2019-03-11

市政污水廠的污泥產量增加，污泥帶來的環(huán)境污染問題日趨嚴重，所以污泥處理迫在眉睫[1]。目前污泥處理技術主要有干化焚燒、土地填埋、厭氧消化和好氧堆肥，其中好氧堆肥因其易于控制且成本較低，是國內外污泥處理行業(yè)的主流技術之一[2-3]。然而，迄今為止污泥堆肥過程中仍然存在著一系列尚未解決的問題，包括調理劑成本控制、重金屬污染、堆肥啟動緩慢等，尤其北方的冬季由于氣溫較低，不利于堆肥微生物的生長繁殖，導致堆肥不能迅速啟動，這會延長堆肥周期，增加堆肥成本[4]。篩選合適的污泥堆肥功能菌株可以改善堆肥過程，提高堆肥產品的品質。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

各功能菌株（淀粉降解菌、蛋白質降解菌、油脂降解菌和纖維素降解菌）分離培養(yǎng)基配制參照王春銘等[5]的方法。

1.2 方法

1.2.1 模擬堆肥。堆肥模擬試驗在堆肥反應器里完成，反應器內徑300 mm、高600 mm，每個反應器中均勻混合放入2.0 kg 脫水污泥和1.0 kg 浮石調理劑。采用強制通風供氧，每個反應器通風速率設定為0.4 L/min。

1.2.2 常規(guī)微生物數量統(tǒng)計。采用常規(guī)平板計數法，稱取1 g堆肥樣本，加入少量滅菌石英砂及少量無菌水研磨后，定容至100 mL，得到10-2菌懸液，依次稀釋得到10-3、10-4和10-5菌懸液。分別吸取100 μL 10-2、10-3、10-4和10-5菌懸液涂布于各種培養(yǎng)基上，分別于各自溫度培養(yǎng)，每個稀釋度3個重復。

1.2.3 各功能菌的初篩復篩。參照王春銘等[6]的方法。

1.2.4 菌種的活化與接種。篩選出的高溫菌種保存于4 ℃冰箱，采用各自的液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，55 ℃150 r/min，裝液量為每個三角瓶 50 mL，搖床培養(yǎng)48 h用于接種污泥堆肥試驗。堆肥試驗接種量采用1%單個菌株，空白處理采用除去菌體的培養(yǎng)基液體代替，減少系統(tǒng)誤差。在堆肥起始階段接入強化菌群，與堆肥物料混勻開始堆肥試驗[7]。

1.2.5 標準方差σ計算公式[8-9]。

σ=1NNi=1（xi-μ）2

式中，x1，x2，…，xN均為試驗中測得或計算所得數據（N≥3）;μ為x1，x2，…，xN的平均值。

2 結果與分析

2.1 功能菌株的分離篩選

首先采用各功能菌的分離培養(yǎng)基進行分離篩選，分別獲得59株有機質降解菌，12株淀粉降解菌，21株蛋白質降解菌，25株油脂降解菌和17株纖維素降解菌，純化后編號置斜面保存，部分試驗照片如圖1。

2.2 污泥有機質降解菌的篩選

對分離純化出的59株有機質降解菌進行污泥有機質降解試驗，以不加菌作為空白對照。污泥有機質去除率大于55%的細菌及污泥有機質去除率大于45%的放線菌列于表1。由表1可知，細菌類降解菌M7、M11，放線菌類降解菌O10 污泥有機質降解率較高，將上述3株菌作斜面保存。

2.3 淀粉降解菌的篩選

對分離純化出的12株淀粉降解菌進行淀粉水解試驗，水解能力大于3的菌株列于表2。綜合考慮菌株的水解能力和淀粉酶活性，可知S1的淀粉酶活性是最高的，達1.3×104 U/mL，將該菌株斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 蛋白質降解菌的篩選

對分離純化出的21株蛋白質降解菌進行蛋白質水解試驗，水解能力大于3的菌株列于表3。綜合考慮菌株的水解能力和蛋白質酶活性，可知P2的淀粉酶活性是最高的，達76.3 U/mL，將該菌株斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 油脂降解菌的篩選

對分離純化出的25株油脂降解菌進行油脂水解試驗，水解能力大于4的菌株列于表4。綜合考慮菌株對油脂的水解能力和油脂酶活性，可知O22的油脂酶活性是最高的，達148.0 U/mL，將該菌株斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 纖維素降解菌的篩選

對分離純化出的17株纖維素降解菌進行纖維素水解試驗，濾紙失重量大于0.3 g 的菌株列于表5。綜合考慮菌株對纖維素的水解能力和纖維素酶活性，可知C15的纖維素酶活性是最高的，達51.5 U/mL，將該菌株斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 篩選結果匯總及鑒定

根據上述篩選結果，通過比對各菌株水解圈大小和酶活性強弱，篩選出理想功能菌株，分別選取酶活性最強的菌株作為優(yōu)選組合的目標菌株進行復合選育，最終確定有機質降解菌為M7、M11、O10，淀粉分解菌S1，蛋白質分解菌P2，油脂分解菌O22和纖維素分解菌C15。綜上，將菌株M7、M11、O10、S1、P2、O22和C15組合成一組混合菌群。對上述7個菌株進行鑒定，采用分子生物學技術測得16S rDNA序列，進行比對分析，完成鑒定。技術路線：菌種基因組DNA提取→16S菌保守序列PCR擴增→3730測序?；蚪MDNA提取，經過電泳檢測確認后，進行PCR擴增，采用細菌通用引物（27f：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT）[10]，根據GeneBank上Blast比對，確認菌屬關系如表6。

3 結論

通過在堆肥高溫期間取樣、分離培養(yǎng)，共分離獲得59株有機質降解菌，12株淀粉降解菌，21株蛋白質降解菌，25株油脂降解菌和17株纖維素降解菌。復篩考察水解圈大小、濾紙失重率，再通過測定酶活，篩選出酶活性最高的菌株，確定最優(yōu)混合菌群由M7、M11、O10、S1、P2、O22和C15組合，經鑒定M7菌株為地衣芽孢桿菌，M11菌株為短小芽孢桿菌，O10菌株為高溫放線菌，S1菌株為地衣芽孢桿菌，P2菌株為莫海威芽孢桿菌，O22菌株為短小芽孢桿菌，C15菌株為凝結芽孢桿菌。后續(xù)將進一步研究該菌群的應用效果。

參考文獻

[1]韓曉芳，顧建新，李燕.污泥處置現(xiàn)狀及新技術探討[J].國外建材科技，2006（5）：43-46.

[2]李?；?污泥高溫好氧堆肥工藝優(yōu)化的研究[D].鄭州：河南工業(yè)大學，2015.

[3]錢東平.城市污水廠污泥堆肥技術研究[J].廣東化工，2014，41（2）：89-90，88.

[4]田寶輝.市政污泥分離及堆肥工藝研究[J].綠色科技，2018（12）：105-106.

[5]王春銘，雷恒毅，王國惠，等.城市污泥模擬堆肥過程中高溫菌群的篩選、鑒定及降解效果[J].環(huán)境科學學報，2007，27（6）：979-986.

[6]王春銘，盧建文，雷恒毅，等.城市污泥堆肥過程中微生物研究[J].生態(tài)環(huán)境，2007，16（2）：462-466.

[7]王守紅，徐榮，朱凌宇，等.不同菌種組合對發(fā)酵殘余物好氧堆肥進程及氮素變化的影響[J].環(huán)境工程學報，2017，11（12）：6429-6436.

[8]王繼海.微生物指標檢測在農村生活飲用水的效果評價[J].中國保健營養(yǎng)，2019，29（9）：398.

[9]李群.優(yōu)生科學資料的統(tǒng)計學深度分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2015，23（9）：131-132.

[10]MENG L Q，LI W G，ZHANG S M，et al.Effects of sucrose amendment on ammonia assimilation during sewage sludge composting[J].Bioresour Technol，2016，210：160-166.