李 紅， 李 波， 鄔婷婷， 楊 曌， 方志堅， 焦德志， 孫嬰寧

(1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院， 黑龍江 齊齊哈爾161005; 2.齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上栽培最多的多年生豆科植物之一，因其具有高產(chǎn)，營養(yǎng)價值高，適應性廣等特點，故稱“牧草之王”[1-2]。生長中的植物常受鹽堿等非生物脅迫，因此，植物發(fā)展了各種復雜的機制來適應這種環(huán)境[3-4]。逆境脅迫時，植物在生理生化和分子水平上均發(fā)生改變，植物生理響應包括了光合能力、光合途徑、發(fā)育階段的調(diào)整、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御及積累相關脅迫功能蛋白等代謝進程的變化。這些生理性狀均隨植物自身發(fā)育進程與環(huán)境不同而改變。植物在次生代謝物水平上通過蛋白與蛋白、蛋白與核酸、蛋白與脂類相互作用及累積滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高抗逆性[5]。

近年來，對紫花苜蓿耐鹽堿基因的研究主要集中在基因克隆和轉(zhuǎn)錄組分析兩方面，例如：Luo等[6]利用RT-PCR技術從鹽處理下的紫花苜蓿中分離出解旋酶基因MH1，其中甘露醇、NaCl、甲基紫精和脫落酸能夠誘導MH1表達。通過對轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsisthaliana)中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和過氧化物酶的檢測證明該基因能夠提高植物滲透調(diào)節(jié)和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的清除能力。Postnikova等[7]對鹽脅迫下紫花苜蓿的根進行轉(zhuǎn)錄組分析，耐鹽型和鹽敏感型品種通過GO注釋得到367 619 586條reads。生物信息學分析表明，鹽脅迫下共1 165 個基因(含86個轉(zhuǎn)錄因子)發(fā)生了改變。與擬南芥的GO注釋比對后有40%的基因差異表達。鹽堿處理以中性鹽、單一堿性鹽為主，而對復合蘇打鹽堿脅迫下紫花苜?？鼓婊蛉狈ο到y(tǒng)性論述，土壤中NaHCO3和Na2CO3含量過高會對植株造成離子毒害作用，紫花苜蓿作為改良鹽堿地土壤的重要牧草，在恢復鹽堿地植被種植、降低土壤pH、提高鹽堿地牧草產(chǎn)量和農(nóng)業(yè)化生產(chǎn)等方面具有重要意義[8]。本研究利用RNA測序(RNA sequencing,RNA-Seq)對混合蘇打鹽堿脅迫前后的紫花苜蓿葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出紫花苜蓿葉片響應混合蘇打鹽堿脅迫下的差異表達基因(Differential-expressed genes,DEGs)。對差異表達基因進行NCBI非冗余蛋白庫(Non-redundant，NR)、基因本體(Gene Ontology，GO)數(shù)據(jù)庫、蛋白直系同源簇數(shù)據(jù)庫(Clusters of Orthologous Groups of proteins，COG)和京都基因和基因組百科全書公共數(shù)據(jù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)注釋和富集分析，從轉(zhuǎn)錄組水平研究紫花苜蓿耐蘇打鹽堿機制，為抗鹽紫花苜蓿的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

以紫花苜蓿WL343HQ幼苗為試驗材料，首先對紫花苜蓿WL343HQ種子進行消毒處理10 min，然后用滅菌水清洗3次，在滅菌水中浸泡2 h，播種到育苗盆中。待幼苗長至三葉一心期時，將生長整齊基本一致的紫花苜蓿幼苗取出用清水洗凈根部，加入1/2改良霍格蘭營養(yǎng)液預培養(yǎng)(3 d)。將紫花苜蓿幼苗分為2組，其中WL-CK組用無菌蒸餾水培養(yǎng)72 h，WL-EG組用150 mmol·L-1的NaHCO3,Na2CO3混合溶液(NaHCO3∶Na2CO3=9∶1,pH=9.11)脅迫(72 h)。取長勢一致葉片大小相近的2組紫花苜蓿葉片于冰箱中冷凍保存(—80℃)，用于轉(zhuǎn)錄組測序，生物學重復3次。

1.2 總RNA提取、檢測及Illumina測序

采用TaKaRa公司的MiniBEST plant RNA Extration Kit提取紫花苜蓿葉片總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100對實驗組、對照組的總RNA濃度進行檢測。由紫花苜蓿葉片提取出的總RNA通過Illumina公司的TruseqTM RNA sample prep Kit獲得mRNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠回收、TBS380定量及cBot橋式PCR擴增形成clusters，在Hiseq4000測序平臺進行雙端測序。Base Calling測序得原始圖像，先轉(zhuǎn)化為Raw Data，去除低質(zhì)量讀段后轉(zhuǎn)化為Clean Data，使用Trinity(http://trinityrnaseq. sourceforge. net/ analysis/ extract proteins from trinity transcripts.html)軟件[16]對所有Clean Data進行從頭組裝。

1.3 差異基因分析方法

紫花苜蓿葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫組裝完成后，采用BWT(Burrows-Wheeler Transform) 算法的Bowtie(http://bowtie-bio.Sourceforge.net/index.shtml)[9]將測序得到的clean reads對應到組裝后得到的轉(zhuǎn)錄組上。通過RSEM(RNA-Seq by Expectation Maximization,http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)[10]軟件來精確衡量Denovo組裝的完整性，利用每千堿基外顯子百萬片段數(shù)FPKM (Fragments per kilobase million)[11]來對PE測序上的RPKM(Reads per kilobase million)[12]進行校正并計算基因差異表達倍數(shù)。利用edge R(Empirical analysis of Digital Gene Expression data in R,http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edge R.html)[13]識別此次轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)差異表達的基因。用多重校驗方法對差異表達基因的閾值p-value進行校正后得錯誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate，F(xiàn)DR)值[14]。我們用FDR<0.05 和∣log2FC≥1∣作為判斷和篩選顯著差異表達基因的條件。使用BlastX分別與NR、COG、GO、KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對獲得注釋信息，使用Goatools (https://github.com/tanghaibao/GOatools)[15]，對經(jīng)過校正的p值(p_FDR)≤0.05 時，認為此GO功能存在顯著富集情況。對于通路的富集分析，使用KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)[16]，把滿足閾值P-Value<0.05條件的通路定義為在DEGs中顯著富集的KEGG通路。

1.4 SSR位點分析

對紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組中的Unigene序列進行簡單重復序列(Simple sequence repeats，SSR)位點分析，采用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)軟件[17](1.0 版，默認參數(shù)：對應的各個unit size的最少重復次數(shù)分別為 1-10，2-6，3-5，4-5，5-5，6-5)對Unigene進行 SSR檢測。

1.5 qRT-PCR驗證

提取對照組和處理組的葉片總RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行qRT-PCR分析。隨機選取5個差異表達基因，利用Primer Premier 3.0軟件設計基因的正反向引物(見表1)，以YHL EF-1α為內(nèi)參基因，各處理均3次重復并計算基因表達量。

表1 DEGs引物信息Tab 1 DEGs primer information

2 結果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序、De novo組裝和序列分析

如表2所示，對試驗中的2個樣品測序后分別獲得了8千萬余條原始序列數(shù)據(jù)，過濾后Clean data占原始序列數(shù)據(jù)95.24%和96.44%；堿基數(shù)占原始堿基數(shù)的88.23%和92.04%；兩個樣品堿基錯誤率分別由0.0378%降低到0.0268%和0.0238%到0.0184%，GC%含量變化不大。測序分析中把Q≥20的堿基作為高質(zhì)量，本研究中Q20值在 96.37%～90.15%之間?；旌?個樣品的高質(zhì)量讀段，用Trinity軟件[18]進行從頭組裝，denovo組裝后共得到91 853 個Unigenes，每個Unigenes的長度為711.67 bp。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果Tab 2 Output statistics of sequencing

Unigenes長度統(tǒng)計如圖1所示?？芍?，這些Unigenes中，序列長度在1 ～ 1 000 bp，1 001 ～ 2 000 bp，2 001 ～ 3 200 bp，3 201～ 5 000 bp之間的序列條數(shù)分別為70 016 (81.23%)，11 465 (12.49%)，4 151 (4.52%)，1 175 (1.28%)，僅445條(0.48%)序列長度大于5 000 bp，從圖中Unigenes長度分布可以看出，隨著序列長度的增加，序列數(shù)逐漸減少，整體呈現(xiàn)下降的趨勢，說明組裝良好。

圖1 組裝后Unigenes長度分布統(tǒng)計圖Fig.1 Unigenes length distribution chart after assembly

2.2 NR庫注釋結果分析

如圖2(A)所示，45 540個Unigenes與NCBI中NR數(shù)據(jù)庫比對中獲得注釋，其中24 765(54.381%)Unigenes與之完全匹配，少數(shù)Unigenes不完全匹配。圖2(B)中，相似度在80%～100%，60%～80%和40%～60%的Unigenes數(shù)及所占比例分別為38 886(85.389%)，6 128(13.456%)，525(1.153%)。如圖2(C)，被注釋到蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)、小鼠(Musmusculus)、大豆(Glycinemax)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、葡萄(Vitisvinifera)、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、硫微螺菌屬(Thiomicrospirasp. MA2-6)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、其他物種和未知物種上的Unigenes數(shù)所占比例分別為62.716%，3.276%，1.968%，1.296%，1.170%，0.773%，0.558%，0.547%，0.505%，6.447%和20.744%，其中被注釋到蒺藜苜蓿上的Unigenes所占比例最大。

圖2 NR功能分類Fig. 2 Classification of NR functions注：圖2(C)中Ⅰ-Ⅺ分別代表蒺藜苜蓿、鷹嘴豆、小鼠、大豆、擬南芥、葡萄、紫花苜蓿、硫微螺菌屬、菜豆、其他物種和未知物種Note:Fig 2(C):I-XI represents Medicago truncatula, Cicer arietinum, Mus musculus, Glycine max,Arabidopsis thaliana,Vitis vinifera,Medicago sativa L.,Thiomicrospira sp. MA2-6,Phaseolus vulgaris,other species and unknown species

2.3 COG注釋結果分析

為了進一步評估苜蓿葉片Unigenes的完整性并預測其功能，現(xiàn)將Unigenes與NCBI中COG數(shù)據(jù)庫進行比對。結果發(fā)現(xiàn)，共13 141個Unigenes被注釋歸納到25個COG功能族上(圖3)，包含Unigenes數(shù)最多的5個代謝途徑分別是：僅一般功能預測(General function prediction only)，信號轉(zhuǎn)導機制(Signal transduction mechanisms)，翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊，分子伴侶(Posttranslational modification,protein turnover,chaperones)，翻譯，核糖體結構與生物發(fā)生(Translation,ribosomal structure and biogenesis)，碳水化合物運輸和代謝(Carbohydrate transport and metabolism)，這些代謝途徑中Unigenes數(shù)及所占比例分別為1 034(7.869%)，1 020(7.762%)，810(6.164%)，722(5.494%)，568(4.322%)。包含Unigenes數(shù)最少2個功能族有胞外結構和核結構，僅有1條，其余Unigenes則被注釋到RNA加工與修飾(RNA processing and modification)，染色體結構與活力(Chromatin structure and dynamics)，防御機制(Defense mechanisms)，細胞運動(Cell motility)等途徑。

圖3 COG功能分類Fig. 3 Classification of COG functions

2.4 GO注釋結果分析

GO數(shù)據(jù)庫共包括三個本體，分別描述分子功能(Molecular function)、細胞組分(Cellular compontent)及生物學過程(Biological process)。對Unigenes進行GO分類結果表明(圖4)，鹽堿處理下的紫花苜蓿葉片，共得到5 484個差異表達基因，其中2 688個Unigenes上調(diào)，2 796個Unigenes下調(diào)，5 484個Unigenes可分為50個功能組，其中包含代謝過程(Metabolic process，up 281，down 282)，細胞過程(Cellular process，up 248，down 249)，單一生物過程(Single-organism process，up 205，down 200)，刺激應答過程(Response to stimulus，up 101，down 91)，生物調(diào)節(jié)(Biological regulation，up 80，down 74)等23個生物學過程，細胞(Cell，up 196，down 211)，細胞器(Organelle，up 138，down 169)，膜(Membrane，up 96，down 109)，細胞器組分(Organelle part，up 77，down 88)等15個細胞組分，結合(Binding，up 253，down 240)，催化活性(Catalytic activity，up 222，down 223)，轉(zhuǎn)運活性(Transporter activity，up 21，down 21)，結構分子活性(Structural molecule activity up，13，down 15)，核酸結合轉(zhuǎn)錄因子活性(Nucleic acid binding transcription factor activity，up 7，down 8)等12個分子功能。

2.5 KEGG注釋結果分析

KEGG通路數(shù)據(jù)庫中包含了在細胞內(nèi)的分子相互作用的信息網(wǎng)絡和具體的變化路徑[19-20]。通過與KEGG數(shù)據(jù)庫的比較，可以更好的了解在鹽堿脅迫誘導下苜蓿葉片中表現(xiàn)較為活躍的生物通路。代謝途徑(Metabolic pathways)(3 504)是被注釋到最多序列的通路，其次是次生代謝產(chǎn)物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)(1 865)、抗生素合成(Biosynthesis of antibiotics)(823)、不同環(huán)境中微生物代謝(Microbial metabolism in diverse environments)(710)、碳代謝(Carbon metabolism)(514)，除上述五大代謝途徑外，包含Unigenes最多的前20個代謝通路如圖5所示，包含核糖體(Ribosome)，Epstein-Barr病毒侵染(Epstein-Barr virus infection)，蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)等途徑。

圖4 GO功能分類Fig.4 GO function classification

圖5 Unigenes最多的前20個通路Fig.5 The top 20 paths contain most unigenes

2.6 Unigenes的通路注釋結果分析

將KEGG數(shù)據(jù)庫作為參考，將Unigenes具體定位到26個主要代謝途徑中(表3)，其中包含unigenes最多的5個分別為代謝途徑(Metabolic pathways，284，12.09%)、次生代謝物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites，154，6.56%)、微生物在不同環(huán)境中的代謝(Microbial metabolism in diverse environments，46，1.96%)、核糖體代謝途徑(Ribosome，46，1.96%)、抗生素生物合成(Biosynthesis of antibiotics，46，1.96%)，而錯配修復(Mismatch repair)、同源重組(Homologous recombination)、谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)、核苷酸切除修復(Nucleotide excision repair)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝(Cysteine and methionine metabolism)等途徑包含DEGs數(shù)較少，為15個，占注釋總基因數(shù)的0.64%。其余則被包含在光合作用途徑(Photosynthesis，43)、植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑(Plant hormone signal transductio，41)、碳代謝途徑(Carbon metabolism，38)、苯丙素生物合成途徑(Phenylpropanoid biosynthesis，36)等。

表3 Unigenes通路注釋結果統(tǒng)計Tab 3 Statistical results of unigenes pathway annotation

2.6 紫花苜蓿蘇打鹽脅迫應答基因及轉(zhuǎn)錄因子分析

利用BLASTP對KEGG注釋通路顯著性分析，發(fā)現(xiàn)許多和蘇打鹽堿脅迫相關的DEGs及轉(zhuǎn)錄因子(如表4)，如木質(zhì)素生物合成相關基因(c66804.1，c65832.1，c60601.1等)，激素信號轉(zhuǎn)導途徑相關基因(c62547.1，c60820.1，c37217.1等)，谷胱甘肽代謝途徑相關基因(c65962.1，c61345.1，c54763.1等)，參與光合作用過程相關基因(c19710.1，c83213.1，c52958.1等)，乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子(c62547.1)，EREBP亞家族轉(zhuǎn)錄因子(c74585.1，c64644.1)，同源異型域轉(zhuǎn)錄因子(c50130.1，c66549.1)，MYB轉(zhuǎn)錄因子(c64519.1，c52531.1，c48627.1)及HSF轉(zhuǎn)錄因子(c51789.1，c41124.1，c29594.1等)。

表4 紫花苜蓿響應蘇打鹽堿脅迫誘導表達重要基因及轉(zhuǎn)錄因子Tab 4 Alfalfa induced expressions of important genes and transcription factor in response to soda saline-alkali stress

2.7 SSR位點分析結果

對紫花苜蓿篩選出的91 853個Unigenes通過SSR位點分析得到10 949個SSR位點(圖6)，包含6種核苷酸基序類型，單核苷酸基序有5 278個，占比最高達到48.205%，五核苷酸基序和六核苷酸基序所占比例最低，分別為0.192%和0.110%。如圖7，在檢測到的SSR核苷酸基序中出現(xiàn)頻率最高的10類基序及所占比例分別為A/T(5 240個，47.858%)、AC/GT(584個，5.334%)、AG/CT(1 422個，12.987%)、AT/AT(313個，2.859%)、AAC/GTT(522個，4.768%)、AAG/CTT(1 007個，9.197%)、AAT/ATT(291個，2.658%)、ACC/GGT(308個，2.813%)、AGG/CCT(161個，1.470%)、ATC/ATG(530個，4.841%)，此SSR特征有助于紫花苜?；蚪M差異分析以及遺傳圖譜的構建。

圖6 核苷酸基序分類圖Fig.6 Classification of nucleotide motifs

圖7 SSR中出現(xiàn)頻率最高的10類基序 Fig.7 The most frequently occurring 10 types of motifs in SSR

2.8 差異表達基因主要轉(zhuǎn)錄因子家族分析

轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心功能蛋白。紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析GH3、MYB、HSF、HD-ZIP、4CL、EREBP、WRKY、ERF等轉(zhuǎn)錄因子家族與蘇打鹽堿脅迫高度相關，其中MYB、HSF、HD-ZIP等轉(zhuǎn)錄因子家族包含基因數(shù)較多，EREBP、WRKY、ERF等轉(zhuǎn)錄因子家族包含基因數(shù)較少。

圖8 紫花苜蓿葉片響應蘇打鹽堿脅迫差異基因轉(zhuǎn)錄因子Fig.8 Transcription factors differentially expressed in leaves of alfalfa under soda saline-alkali stress

2.9 差異表達基因qRT-PCR驗證結果分析

為了驗證差異基因數(shù)據(jù)的可靠性，隨機選取5個差異表達基因，其中4個基因上調(diào)，1個基因下調(diào)，qRT-PCR熒光定量結果表明，5個基因在蘇打鹽堿脅迫脅迫后的表達趨勢與RNA-Seq結果一致(圖9)，說明測定轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

圖9 差異表達基因qRT-PCR驗證Fig.9 Verification of differentially expressed genes by qRT-PCR注：A、B、C、D、E分別代表c48910.1、c54763.1、c66291.3、c70714.3、c65586.1Note：A、B、C、D、E significant c48910.1、c54763.1、c66291.3、c70714.3、c65586.1

3 討論

轉(zhuǎn)錄組學(transcriptomics) 是功能基因組學研究的一個重要內(nèi)容，它是從整體水平上研究細胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律。隨著新一代測序技術的發(fā)展，其高通量性、低成本、快速、準確的特點可大大提高測序的效率，降低試驗成本，為RNA水平研究基因表達提供有效方法。

在鹽堿等非生物脅迫下，植物通過基因的改變來調(diào)控代謝及信號轉(zhuǎn)導途徑，從轉(zhuǎn)錄和翻譯等水平上作出響應，逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄因子會激活或抑制下游基因的表達[21]。本研究中鑒定出GH3、MYB、HSF、HD-ZIP、4CL、EREBP、WRKY、ERF等轉(zhuǎn)錄因子與紫花苜蓿耐鹽堿性相關，說明紫花苜蓿耐鹽堿性應答機制是由多種轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控。

ABA(Abscisic acid)信號轉(zhuǎn)導通過PYR/PYL/RCAR蛋白與蛋白磷酸酶2C(Protein phosphatase 2C，PP2C)家族的A類蛋白結合，釋放磷酸化蔗糖非酵解型蛋白激酶2(Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase2)，從而激活ABA信號轉(zhuǎn)導下游基因的表達[22]。本研究中共鑒定出5個PP2C家族基因，其中4個上調(diào)，1個下調(diào)，推測該基因在紫花苜蓿逆境脅迫中起關鍵性作用。生長素早期應答基因分為Aux/IAAs,GH3s,SAURs三種，參與植物頂端優(yōu)勢、根部形成和逆境脅迫等過程[23]。GH3蛋白具有吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)和茉莉酸(Jasmonic acid，JA)等激素氨基酸化合成酶功能，參與植物光合作用途徑[24]。本研究中，c60820.1，c37217.1，c66609.1等差異表達基因全部上調(diào)，說明GH3家族基因在植物防衛(wèi)反應過程起重要作用。

AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄家族包含AP2和EREBP兩個亞族，與植物的逆境響應有關，其中ERF轉(zhuǎn)錄因子會激活抗氧化基因的表達，減輕植株氧化損傷[25-26]。本研究共鑒定出2個下調(diào)EREBP基因和2個上調(diào)ERF基因，說明ERF基因主要通過增強乙烯的生物合成來增強紫花苜蓿的耐鹽性，即兩類基因均參與紫花苜蓿鹽堿脅迫應答過程，但調(diào)控方式不同。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，紫花苜蓿在應對非生物脅迫過程中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因過表達以適應逆境環(huán)境[27]。例如：擬南芥中過表達WRKY25和WRKY33基因能提高耐鹽性，過表達WRKY46,WRKY54,WRKY70能提高植株對干旱的耐受性[28-29]。本研究僅鑒定出1個WRKY基因，說明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在響應蘇打鹽堿脅迫過程中作用較小。

蘇打鹽堿脅迫產(chǎn)生的活性氧會對植株造成氧化損傷，研究表明鹽脅迫下擬南芥谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPX)基因均上調(diào)表達[30]。本研究中共鑒定出9個谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶基因，7個上調(diào)表達，2個下調(diào)表達，這些基因均參與ROS的清除系統(tǒng)，減緩蘇打鹽堿脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片的氧化脅迫，從而增強其耐鹽堿性。小家族熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)對植物提高非生物脅迫的耐受性起重要作用[31]。本研究共鑒定出16個HSF轉(zhuǎn)錄因子家族基因，其中10個上調(diào)表達，6個下調(diào)表達，說明HSF家族轉(zhuǎn)錄因子與鹽堿脅迫應答具一定的關聯(lián)性。

4 結論

本試驗采用RNA-Seq技術篩選出許多與鹽堿脅迫有關的差異表達基因，其中2 688個上調(diào)基因和 2 796 個下調(diào)基因。發(fā)現(xiàn)GH3,MYB,HD-ZIP,EREBP,WRKY,ERF等轉(zhuǎn)錄因子與紫花苜蓿耐鹽堿性相關。通過GO注釋和KEGG注釋分析發(fā)現(xiàn)，這些基因主要參與核糖體途徑、光合作用途徑、植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑、氧化磷酸化途徑、谷胱甘肽代謝途徑、苯丙氨酸代謝途徑等許多代謝途徑，但我們對這些基因?qū)Υx途徑的調(diào)控機制了解甚少，需深入研究，從而進一步了解紫花苜蓿鹽堿脅迫調(diào)控機制。