飼料中維生素檢測(cè)方法探討

宋亞偉 劉發(fā)全 吳昊 蔡?hào)|東

（安徽省獸藥飼料監(jiān)察所 230091）

1 維生素的基本情況

1.1 維生素簡(jiǎn)介

維生素，即維持生命的物質(zhì)，是維持生命活動(dòng)必需的一類有機(jī)物質(zhì)。維生素在生物體內(nèi)的含量很少，但不可或缺[1]。在動(dòng)物生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。維生素在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)主要起催化作用，促進(jìn)一些營(yíng)養(yǎng)素的合成和降解，進(jìn)而調(diào)節(jié)和控制機(jī)體代謝。如果動(dòng)物機(jī)體缺乏維生素，其生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖機(jī)能會(huì)受到影響，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)特殊的疾病。

維生素體內(nèi)合成較少，必須由飼糧提供，是畜禽飼料中的必需成分[2]。由于需要量極少，為保證加入飼料中的均勻性，一般在飼料生產(chǎn)過程中多以維生素預(yù)混合飼料或復(fù)合預(yù)混合飼料的形式添加，目的是有利于微量維生素均勻分散于大量的配合飼料中。

1.2 維生素類型

目前，飼料中常見的維生素有14 種[3]，按照溶解性可以分為脂溶性維生素和水溶性維生素2 大類。脂溶性維生素有4種：VK3、VA、VD3、VE； 水溶性維生素有10 種：VC、VB1、VB2、VB6、VB12、葉酸、膽堿、煙酸、泛酸、生物素。除此之外，還有部分類維生素：肌醇、L-肉堿、β-胡蘿卜素、甜菜堿、輔酶Q、卡尼汀、硫辛酸等。

1.2.1 脂溶性維生素

脂溶性維生素(VA、VD3、VE、VK3) 都是含有環(huán)結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)的脂肪族烴鏈[4]。這4 種維生素雖然每一種都至少有一個(gè)極性基團(tuán)，但這些維生素都是疏水的，溶于有機(jī)溶劑（三氯甲烷、乙醚、環(huán)己烷、石油醚，微溶于乙醇）。

1.2.2 水溶性維生素

水溶性維生素指的是能在水中溶解的一組維生素，一般是輔酶或輔基組成部分，包含在酶的催化反應(yīng)中起重要作用的B族維生素等。

2 飼料中維生素的檢測(cè)方法

由于維生素源自不同類別的復(fù)合物，其紫外、紅外、核磁共振、熒光特性有很大區(qū)別。維生素檢測(cè)方法一般采用高效液相色譜分析系統(tǒng)（紫外或熒光），基本操作過程提取、濃縮、高效液相色譜檢測(cè)。該方法分離效率高，選擇性好，檢測(cè)靈敏度高，操作自動(dòng)化，應(yīng)用范圍廣，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高。

2.1 脂溶性維生素的檢測(cè)

提取：直提法、皂化法（水浴，超聲，恒溫?fù)u床）；

凈化：稀釋、液液萃取（分液漏斗）；

檢測(cè)：HPLC-DAD/UV。

直提法適用于維生素預(yù)混合飼料中VD3和VA的測(cè)定，但不適用于水溶性劑型。預(yù)混合飼料中的VA用甲醇提取，試樣注入液相色譜柱，在326nm 處測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算VA的含量。優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確。缺點(diǎn)是不適用于檢測(cè)配合料、濃縮料及復(fù)合預(yù)混合飼料，該法無(wú)法避免微量元素對(duì)檢測(cè)的干擾，同時(shí)不能檢測(cè)水溶性劑型的脂溶性維生素。

皂化法適用于配合飼料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料、維生素預(yù)混合飼料中VA、VD3、VE的測(cè)定。用有機(jī)溶劑萃取樣品液，通過高效液相進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)是皂化過程中可以將飼料中VA和VE的乙酸酯和棕櫚酸酯形態(tài)轉(zhuǎn)化為游離的視黃醇和生育酚，同時(shí)將飼料中的微量元素等金屬離子沉淀，并將干擾維生素檢測(cè)的脂肪和磷脂皂化成水溶性物質(zhì)，減少基質(zhì)干擾。缺點(diǎn)是該法中的堿液不易去除，需進(jìn)行多次液液萃取才能將皂化液洗滌成中性。該過程操作煩瑣，極易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且因步驟較多容易引進(jìn)誤差或造成樣品損失[5]。

2.2 水溶性維生素的檢測(cè)

水溶性維生素的檢測(cè)方法很多[6]，有大量文獻(xiàn)報(bào)道，利用不同方法對(duì)飼料、水果、藥品、飲料、發(fā)酵乳制品中的維生素進(jìn)行測(cè)定。飼料中使用的方法為熒光法和高效液相色譜法，且以高效液相法最為常用。

3 影響維生素檢測(cè)準(zhǔn)確性的因素

3.1 維生素自身的穩(wěn)定性

維生素的化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，容易受到金屬離子的影響發(fā)生催化氧化，并在酸堿、光照的環(huán)境中容易分解，在飼料加工、運(yùn)輸、貯存過程中也會(huì)受到破壞[7]。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，每種維生素都有其獨(dú)特的反應(yīng)特點(diǎn)，表現(xiàn)為對(duì)pH、溫度、光、氧有不同的穩(wěn)定性[8]。參見表1～2。

3.2 方法的選擇

分析方法選擇不當(dāng)造成分析不適用或不完全適應(yīng)。

3.3 人為因素

分析過程中實(shí)驗(yàn)人員操作不當(dāng)。

3.4 儀器或試劑不合格

如容量瓶、滴定管的刻度未經(jīng)過檢定； 天平的靈敏度達(dá)不到工作要求； 使用過期標(biāo)液等均會(huì)產(chǎn)生誤差。

3.5 實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件發(fā)生變化

表1 維生素的穩(wěn)定性影響因素

表2 維生素的穩(wěn)定性

一般情況下，影響維生素檢測(cè)的環(huán)境條件主要指相對(duì)濕度、溫度及光照，是隨機(jī)誤差，屬不可測(cè)誤差。

3.6 樣品因素

試樣中被測(cè)組分分布不均勻。

4 檢測(cè)方法的優(yōu)化

4.1 選擇合適的分析方法

在選擇分析方法時(shí)，需要根據(jù)組分含量和對(duì)準(zhǔn)確度的要求在條件允許的情況下選擇最佳的分析方法。

4.2 增加平行測(cè)定的次數(shù)

增加試驗(yàn)的測(cè)定次數(shù)可減少偶然誤差。

4.3 減少測(cè)量誤差

誤差是客觀存在的，不可避免，但又可以控制。只要有測(cè)量必然就有誤差，測(cè)量誤差自始至終存在科學(xué)實(shí)驗(yàn)和測(cè)量過程中，但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們認(rèn)識(shí)能力的提高，檢測(cè)技術(shù)、檢測(cè)方法的提升測(cè)量誤差越來(lái)越小，但不能為零。

4.4 正確記錄有效數(shù)字

4.5 消除測(cè)定中的系統(tǒng)誤差

4.5.1 增加對(duì)照試驗(yàn)

由不同分析人員,不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)照； 與標(biāo)準(zhǔn)試樣的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果對(duì)照； 選擇國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分析方法或者公認(rèn)的經(jīng)典分析方法對(duì)照；與其他成熟的分析方法對(duì)照； 增加基質(zhì)加標(biāo)與回收率實(shí)驗(yàn)。

4.5.2 增加空白試驗(yàn)

空白試驗(yàn)可以消除由試劑、實(shí)驗(yàn)器皿和環(huán)境引入的雜質(zhì)造成的系統(tǒng)誤差，但空白值不可太大。

4.5.3 校準(zhǔn)儀器

通過校準(zhǔn)儀器來(lái)減小其影響。

5 結(jié)論

維生素的檢測(cè)方法一般采用高效液相色譜分析系統(tǒng)（紫外或熒光），基本操作過程是提取、濃縮、高效液相色譜檢測(cè)。該方法分離效率高，選擇性好，檢測(cè)靈敏度高。但由于分析方法選擇不當(dāng)，每種維生素都有其獨(dú)特的反應(yīng)特點(diǎn)，表現(xiàn)為對(duì)pH、溫度、光、氧有不同的穩(wěn)定性，分析過程中實(shí)驗(yàn)人員操作不當(dāng)，儀器或試劑不合格，試樣中被測(cè)組分分布不均勻等因素可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，要選擇合適的分析方法、增加平行測(cè)定次數(shù)、減少測(cè)量的誤差、增加對(duì)照試驗(yàn)、校準(zhǔn)儀器，以提高分析結(jié)果。