曹 祥 韋 偉 黃曉燕 羊 玲

彌漫性大B細(xì)胞淋巴癌(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是源于在淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤的總稱.淋巴癌是一種高度異質(zhì)性疾病,患者初期表現(xiàn)為無痛性淋巴腫大,并累及多個器官[1-2].當(dāng)前,我國青少年DLBCI發(fā)病率不斷上升,探索新的預(yù)后分層方法和個體化差異對于治療淋巴癌是一種新的嘗試,其目的在于增加淋巴癌臨床療效,對于淋巴癌患者的生存具有重要意義.Wnt信號是由多個Wnt配體、多個跨膜受體(Frizzled,FZD)組成,而β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是其中主要效應(yīng)因子,當(dāng)Wnt蛋白與受體結(jié)合時可以加強β-catenin(Wnt/β-catenin)的穩(wěn)定性.在淋巴癌細(xì)胞組織中,Wnt/β-catenin因子的活性比在正常人群的淋巴細(xì)胞中含量明顯增多,其在淋巴細(xì)胞發(fā)育及多種惡性血液病中也具有重要作用[4-6].微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)是一大類miRNA腫瘤抑制基因,其作用在于能夠縮短腫瘤細(xì)胞的存活和周期,目前已在臨床試驗中作為抗癌治療藥物之一[7-8].miR-34廣泛存在多種生物體內(nèi),可以靶向調(diào)節(jié)淋巴癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯,還可以抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致淋巴癌細(xì)胞周期縮短、衰老及死亡.本研究通過觀察miR-34a靶向調(diào)控Wnt/β-catenin信號對小兒淋巴癌細(xì)胞凋亡的機制研究.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

淋巴癌細(xì)胞株A554和正常淋巴細(xì)胞株11-ZAD[美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC)];Wnt/β-catenin培養(yǎng)基和胎牛血清(上海優(yōu)予生物科技有限公司);miR-34a、miR-34a抑制物(miR-34a inhibito)(北京孚博生物科技有限公司);RNA-iMAX(上海斯信生物科技有限公司);免疫組化試劑盒(赫澎上海生物科技有限公司);Wnt/β-catenin抑制基因試劑(美國BD公司);BD FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀(北京安麥格貿(mào)易有限公司);Getein1100型免疫熒光檢測儀(南京基蛋生物科技股份有限公司);Western blot ZY5型電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司).

1.2 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與實驗分組

將淋巴癌細(xì)胞株A554和正常淋巴細(xì)胞株11-ZAD分別進(jìn)行溶液配置,對淋巴癌株A554細(xì)胞和正常淋巴11-ZAD加入濃度為80 mol/L的紅霉素和青霉素(100 U/m),放入12%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(25 mmol/L).在37.5 ℃條件下培養(yǎng)24 h,更換培養(yǎng)基24 h一次,當(dāng)淋巴癌株A554和正常淋巴細(xì)胞株11-ZAD融合度達(dá)到90%時取生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗.

將淋巴癌細(xì)胞株A554實驗分為3組:①淋巴癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物(mimics)組(miR-34a mimics組);②淋巴癌細(xì)胞組;③淋巴癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a抑制物(inhibitor)組(miR-34a inhibitor組).

1.3 淋巴癌細(xì)胞株A554轉(zhuǎn)染

采用轉(zhuǎn)染試劑RNAiMAX試劑盒,按照說明書所述方法將miR-34a mimics和miR-34a inhibitor各30 pmol/ml,分別與RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑混合制備復(fù)合物,置于室溫放置5 min.將有機復(fù)合物加入細(xì)胞中轉(zhuǎn)染48 h,每組設(shè)置復(fù)孔2個以上,更換正常培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)分析,當(dāng)淋巴癌細(xì)胞株A554濃度達(dá)到40%~50%時,利用miR-34a mimics、miR-34a inhibitor和陰性對照(negative control,NC)轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞株中,4 h后將培養(yǎng)液換為含有8%血清的高糖培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)48 h,隨后按照RNAiMA操作說明配制樣品,收集實驗后的淋巴癌細(xì)胞.

1.4 免疫組化檢測

將各組淋巴癌細(xì)胞株中的分泌型糖蛋白(Dickkopf-1,DKK1)和Wnt抑制因子1(wnt inhibitory factor-1,WIF-1)蛋白進(jìn)行檢測,注入2%甲醛中固定過24 h,脫水且涂上石蠟連續(xù)切片,切成長寬高為(1.5X1.5X1.5)μm塊狀.誘導(dǎo)24 h、48 h作為實驗組,采用Masson法觀察miR-34a細(xì)胞株中的膠原進(jìn)行沉積,采用蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色法檢測3組DKK1、WIF-1和miR-34a活性.

1.5 流式細(xì)胞儀檢測

將各組淋巴癌細(xì)胞以2X106個/ml濃度置于6孔板,培養(yǎng)24 h,用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,用冷的70%的乙醇固定,于4 ℃放置1 d后離心5 min倒掉上清液,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌5 min,重復(fù)3次,在37 ℃無光照下染色30 min,采用流式細(xì)胞儀分析淋巴癌細(xì)胞凋亡程度.

1.6 Western blot檢測

在6孔板中加入100 μg的胰蛋白酶提取液,注入3 ml的培養(yǎng)基停止消化,將細(xì)胞提取液放入微量離心(eppendorf,EP)管中,并與胰蛋白酶提取液按照1∶100進(jìn)行混合,再放入冰箱中冷凍10 min,使細(xì)胞完全裂變成為E溶液,在EP管中放入一株淋巴癌細(xì)胞組織,并按照1∶100比例加入胰蛋白酶提取液3 ml,使細(xì)胞完全裂變成為F溶液,再將E溶液和F溶液以80∶1的體積進(jìn)行搖勻,配制成工作液放入37.5 ℃的保溫箱中20 min,冷卻后計算Wnt/β-catenin蛋白的濃度水平.

1.7 免疫熒光檢測

將淋巴癌細(xì)胞以5X104/ml濃度水平置于12孔板中(有蓋玻片),用4%多聚甲醛固定10 min,PBS洗滌;用0.5%非離子表面活性劑(Triton)處理10 min,用PBS洗滌,用濃度為3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉1 h后用PBS洗滌,培育24 h,用PBS洗滌3次,加入羊抗小鼠IgG Alexa Flour488(1∶200)在室溫、無光的條件下培育1 h,用PBS洗滌3次后加入4,6-二乙?；?2-苯基癸酸酯(4,6-diacetyl-2-phenyl decanoate)在室溫、無光的條件下染色10 min,用PBS洗滌2次后將蓋玻片移到載玻片上,用抗熒光衰減封片劑封片,放置于熒光顯微鏡下觀察.

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0分析所有數(shù)據(jù),3組淋巴癌細(xì)胞的DKK1、WIF-1、Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)及凋亡情況的差異性采用卡方檢驗,組間數(shù)據(jù)比較采用單因素分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s))表示,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 miR-34a在淋巴癌細(xì)胞株A554和正常淋巴細(xì)胞株11-ZAD中的表達(dá)

在淋巴癌細(xì)胞組中,miR-34a表達(dá)明顯低于正常淋巴細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.517,P<0.01),見圖1.

圖1 miR-34a的活性表達(dá)

2.2 免疫組化檢測DKK1和WIF-1的活性

miR-34a mimics組淋巴癌細(xì)胞中DKK1和WIF-1的活性表達(dá)均高于淋巴癌細(xì)胞組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.455,t=8.233,P<0.01);淋巴癌細(xì)胞組淋巴癌細(xì)胞中DKK1和WIF-1的活性表達(dá)均高于miR-34a inhibitor組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.449,t=9.233,P<0.01),見圖2和圖3.

圖2 三組淋巴癌細(xì)胞DKK1和WIF-1蛋白活性(X400)

圖3 三組淋巴癌細(xì)胞DKK1和WIF-1蛋白表達(dá)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測miR-34a對淋巴癌細(xì)胞的凋亡影響

miR-34a mimics組、淋巴癌細(xì)胞組和miR-34a inhibitor組的淋巴癌細(xì)胞凋亡率分別為49.82%、35.77%和22.49%.miR-34amimics組的淋巴癌細(xì)胞凋亡最強,淋巴癌細(xì)胞組的淋巴癌細(xì)胞與miR-34amimics組相比,細(xì)胞凋亡速度減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=5.383,P<0.01);miR-34a inhibitor組淋巴癌細(xì)胞凋亡最慢,與miR-34amimics組和淋巴癌細(xì)胞組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=13.248,x2=10.076;P<0.01),提示其增值明顯受到miR-34a的影響,miR-34a表達(dá)越高淋巴癌細(xì)胞凋亡越快,見圖4和圖5.

圖4 三組淋巴癌細(xì)胞凋亡情況

圖5 三組淋巴癌細(xì)胞凋亡率比較

2.4 Western blot檢測淋巴癌細(xì)胞中 Wnt/β-catenin蛋白濃度

在Western blot檢測中,miR-34a mimics組淋巴癌細(xì)胞中Wnt蛋白和β-catenin蛋白濃度水平明顯少于淋巴癌細(xì)胞組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.483,t=16.489;P<0.01);淋巴癌細(xì)胞組的Wnt蛋白和β-catenin蛋白濃度水平明顯少于miR-34a inhibitor組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.628,t=7.853,P<0.01),見圖6和圖7.

圖6 三組淋巴癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)

圖7 三組淋巴癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin蛋白相對表達(dá)量

2.5 免疫熒光法檢測淋巴癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)

在免疫熒光法檢測中,miR-34a mimics組淋巴癌細(xì)胞中的Wnt蛋白和β-catenin蛋白表達(dá)明顯低于淋巴癌細(xì)胞組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.479,t=7.459;P<0.05);淋巴癌細(xì)胞組淋巴癌細(xì)胞中Wnt蛋白和β-catenin蛋白表達(dá)顯著低于miR-34a inhibitor組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.239,t=7.689;P<0.05),見圖8和圖9.

圖8 三組淋巴癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin蛋白活性

圖9 三組淋巴癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)量

3 討論

2008年,世界衛(wèi)生組織將淋巴癌規(guī)劃為需要化療的由B細(xì)胞引發(fā)的腫瘤疾病,起源于生發(fā)中心濾泡輔助T細(xì)胞,具有特殊的生物學(xué)特征及臨床表現(xiàn),其特點在于具有較強的侵襲性生長特性,常常發(fā)生于青少年,預(yù)后較差,分為原發(fā)性和進(jìn)展性[9-11]兩種形式.各種類型的亞基在臨床上都具有治療難度大、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差的特征,目前是醫(yī)學(xué)界的難題[12-13].針對于淋巴瘤的發(fā)病機制目前仍未明確,所以進(jìn)一步了解淋巴癌的發(fā)病機制和突破點尤為重要.

本研究結(jié)果顯示,在淋巴癌細(xì)胞當(dāng)中,miR-34a的活性明顯低于正常淋巴細(xì)胞.miR-34a mimics組、淋巴癌細(xì)胞組和miR-34a inhibitor組的淋巴癌細(xì)胞凋亡率分別為49.82%、35.77%和22.49%,表明淋巴癌細(xì)胞凋亡明顯受到miR-34a干預(yù)的影響,miR-34a表達(dá)越高淋巴癌細(xì)胞凋亡越快.miR-34a在腫瘤細(xì)胞組織的生長和發(fā)展過程中具有重要作用,其缺失或者凋亡可能是癌細(xì)胞生存和發(fā)育的最大優(yōu)勢.免疫組化法中觀察淋巴癌細(xì)胞中的DKK1和WIF-1的活性結(jié)果顯示,在miR-34a mimics組淋巴癌細(xì)胞中DKK1和WIF-1活性表達(dá)均高于淋巴癌細(xì)胞組,淋巴癌細(xì)胞組DKK1和WIF-1活性表達(dá)均高于miR-34a inhibitor組.DKK1和WIF-1因子其為抑癌基因,與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系,在淋巴癌細(xì)胞形成和生長過程起負(fù)調(diào)控作用,DKK1和WIF-1能夠使癌癥內(nèi)信號因子磷酸化,使其在細(xì)胞漿內(nèi)被水解,被水解的主要原因在于炎性受體Lrp5結(jié)合形成多聚體復(fù)合物在其中發(fā)揮作用,該過程阻斷炎癥信號通路的正常傳導(dǎo),阻礙癌癥內(nèi)信號分子進(jìn)入細(xì)胞核.Khalili等[14]和Kandimalla等[15]的研究表明,在淋巴癌疾病中,DKK1和WIF-1可以增加對淋巴癌中炎性因子抑制作用,修復(fù)被破壞的細(xì)胞活性,失去活性凋亡,對淋巴癌細(xì)胞起破壞作用.

Western blot方法檢測Wnt/β-catenin蛋白濃度,其結(jié)果顯示miR-34a mimics組淋巴癌細(xì)胞Wnt/β-catenin蛋白濃度明顯低于淋巴癌細(xì)胞組,淋巴癌細(xì)胞組淋巴癌細(xì)胞Wnt/β-catenin蛋白濃度顯著組低于miR-34a inhibitor組,在免疫熒光檢測Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:miR-34a mimics組淋巴癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號活性表達(dá)明顯低于淋巴癌細(xì)胞組和miR-34a inhibitor組,淋巴癌細(xì)胞組的活性低于miR-34a inhibitor組.Wnt信號是機體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,一是經(jīng)典的Wnt信號;二是非經(jīng)典的Wnt信號通路,能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長、分化和發(fā)育[4,16].經(jīng)典Wnt信號通路即Wnt/β-catenin,也是一種生物學(xué)行為的關(guān)鍵信號通路,在細(xì)胞中具有增殖、分化、遷移以及侵襲的特點[17-19].過度的激活與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),在許多淋巴癌癌細(xì)胞中可檢測到Wnt和β-catenin,而在無癌的淋巴組織中含量明顯減少或者無法檢測.Cao等[20]和Ping等[21]研究發(fā)現(xiàn),在急性淋巴癌患者組織細(xì)胞標(biāo)本中有WNT信號的表達(dá),并且在受到外界刺激時在細(xì)胞核中有觀察到β-catenin的增多,癌細(xì)胞的活性和周期都明顯增加.因此,Wnt/β-catenin信號的活性增強時,可以加速對淋巴癌細(xì)胞組織的擴散及加重患者病情,與本研究結(jié)果相似.

miR-34a通過靶向抑制Wnt/β-catenin信號,促進(jìn)DKK1和WIF-1活性表達(dá),從而加速淋巴癌細(xì)胞凋亡,緩解小兒淋巴癌病癥.