楊秀清,劉亞妮

聯(lián)苯代謝對微生物的生長脅迫及分裂抑制

楊秀清*,劉亞妮

(山西大學生物技術研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

以聯(lián)苯/多氯聯(lián)苯降解菌株R04(sp. R04)和幾種模式微生物為研究對象,利用高效液相色譜、熒光顯微鏡、掃描電子顯微鏡等分析微生物在聯(lián)苯及其代謝物培養(yǎng)條件下細胞分裂和形態(tài)的變化.結果表明聯(lián)苯及其代謝產(chǎn)物對紅球菌R04和幾種模式微生物細胞的分裂有抑制作用,并對部分微生物形態(tài)有影響.與前體-聯(lián)苯及其代謝產(chǎn)物2-羥基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸相比, 2,3-二羥基聯(lián)苯對G+、G-細菌,或是酵母細胞分裂都有較強的抑制和形態(tài)的改變. 2,3-二羥基聯(lián)苯導致. R04和缺陷型. R04細胞形成不完整隔膜的比例增加;造成96.4%的大腸桿菌BL21細胞表面凹陷,胞質內(nèi)容物流失,菌體體積縮小;導致枯草芽孢桿菌89.6%的細胞體積明顯縮小;導致金黃色葡萄球菌基本沒有細胞能形成完整的分裂隔膜;導致紅酵母細胞能進行出芽生殖的比例從64.2%降低到19.3%,但對其細胞形態(tài)無明顯改變.聯(lián)苯代謝物2,3-二羥基聯(lián)苯對紅球菌R04及其它微生物細胞分裂和增殖的抑制作用比其前體-聯(lián)苯強,建議在研究環(huán)境化合物與微生物互作時,應考慮環(huán)境化合物代謝的毒性效應.

聯(lián)苯代謝；紅球菌R04；細胞分裂；環(huán)境化合物

芳香烴及其衍生物是一類較為常見的環(huán)境化合物,其中包括聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯(PCBs)[1],其理化性質極為穩(wěn)定,并被廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)[2].然而聯(lián)苯和PCBs都有很強的毒性,能夠長期穩(wěn)定的存在于環(huán)境中,對人類健康及生態(tài)環(huán)境具有很大的危害性[3-5].紅球菌R04(sp. R04)是一株可以有效降解聯(lián)苯/PCBs的革蘭氏陽性細菌[6],和伯克霍爾德氏菌、假單胞菌、紅球菌RHA1等具有相同的聯(lián)苯/PCBs的代謝酶系.在聯(lián)苯/PCBs代謝過程中,聯(lián)苯首先被聯(lián)苯雙加氧酶氧化為2,3-二氫二羥基聯(lián)苯,繼而在2,3-二氫二羥基聯(lián)苯脫氫酶作用下形成2,3-二羥基聯(lián)苯(DHBP);DHBP在第二個雙加氧酶作用下產(chǎn)生黃色的開環(huán)產(chǎn)物2-羥基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸(HOPDA),該產(chǎn)物被水解為苯甲酸;最后通過粘糠酸途徑被降解[7-9].

當有機體接觸聯(lián)苯、PCBs等環(huán)境化合物時,這些化合物對有機體的生長發(fā)育會造成一定程度的影響.例如PCBs會改變伯克氏菌的比表面,引起細胞輕微的質壁分離[10],同時會抑制芽孢桿菌屬,假單胞菌屬,微球菌屬和沙雷氏菌屬細菌的生長[11].聯(lián)苯和PCBs等化合物不僅能夠抑制細菌細胞的生長,而且對動植物也產(chǎn)生毒副作用.有研究報道曾吃過被PCBs污染的魚類的女性分娩的兒童記憶力、注意力以及智商下降,表明這些化合物對發(fā)育中的胎兒大腦有強烈的副作用[12],而且Berg等[13]研究發(fā)現(xiàn),PCBs、二苯并呋喃(PCDFs)使鸕鶿的繁殖率降低,后代重量減輕.同時還發(fā)現(xiàn)高含量的PCBs可使絳柳葉片白化,莖稈次生結構受到抑制,根細胞內(nèi)含物減少,根系細胞受到不同程度的破壞[14].

本課題組前期對紅球菌R04降解聯(lián)苯/PCBs的能力做了大量研究,發(fā)現(xiàn)鹵代聯(lián)苯環(huán)上不同取代元素以及取代元素的數(shù)量、位置對其降解產(chǎn)生較大影響[15];同時發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯/PCBs代謝過程中,. R04的分裂方式?jīng)]有受到影響[16],但聯(lián)苯/PCBs會導致. R04細胞不能形成完整的分裂隔膜,進而導致分裂受阻,細胞呈現(xiàn)絲狀化[17].目前國內(nèi)外的研究主要集中于環(huán)境化合物本身對微生物生長和分裂的影響,很少有學者研究環(huán)境化合物中間代謝物對微生物的分裂、增殖和發(fā)育是否產(chǎn)生影響,本文中. R04代謝聯(lián)苯/PCBs過程中會形成多種中間代謝物,究竟是哪種代謝物或是聯(lián)苯影響了. R04的生長和分裂尚不清楚.因此,本文分別用聯(lián)苯及其代謝物DHBP和HOPDA培養(yǎng). R04、代謝酶缺陷型. R04,通過顯微和超顯微觀察細胞來確定影響. R04生長和分裂的物質.其次,選擇大腸桿菌BL21、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌、紅酵母來探究聯(lián)苯及其代謝物對其它微生物細胞生長和分裂的影響,為探討環(huán)境化合物代謝與微生物的互作研究奠定基礎.

1 材料和方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和生長條件

實驗所用的紅球菌R04、代謝酶缺陷型紅球菌R04(聯(lián)苯雙加氧酶缺失的菌株命名為. R04△A,2,3-二羥基聯(lián)苯-1,2雙加氧酶缺失的菌株命名為. R04△C,2-羥基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸水解酶缺失的菌株命名為. R04△D)、大腸桿菌BL21、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌、紅酵母均由本實驗室保存.所用培養(yǎng)基為基礎礦物培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基.

培養(yǎng)基配方具體如下,基礎礦物培養(yǎng)基(1L): KH2PO4,2.93g;K2HPO4·3H2O,5.87g;MgSO4·7H2O,0.3g;FeSO4·7H2O,0.01g;NaCl,0.2g;(NH4)2SO4,5g;NiSO4·7H2O, 0.006g;CaCl2,0.03g;丁二酸鈉,1g;微量元素鹽溶液200μL.微量元素溶液(1L):Na3-Citrate·2H2O,0.18g; FeSO4·7H2O,0.034g;CoCl2·6H2O,0.005g;Na2MoO4·2H2O,0.005g;CuSO4·5H2O,0.004g;MnCl2·4H2O,0.002g;ZnCl2, 0.003g;H3BO3,0.002g.分別在基礎礦物培養(yǎng)基中加入葡萄糖、聯(lián)苯及其代謝物作為碳源.LB液體培養(yǎng)基(1L):胰蛋白胨10g,酵母膏5g,氯化鈉5g,加水定容至1L.YPD液體培養(yǎng)基(1L):胰蛋白胨20g,酵母膏10g,葡萄糖20g,加水定容至1L.

紅球菌R04分別接種于基礎礦物培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基中,30℃,200r/min恒溫震蕩培養(yǎng);大腸桿菌BL21、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌接種于LB液體培養(yǎng)基中37℃,200r/min恒溫震蕩培養(yǎng);紅酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中30℃, 200r/min恒溫震蕩培養(yǎng).

1.2 主要試劑和儀器

聯(lián)苯購于軍事醫(yī)學科學院試劑站,戊二醛購于上海生工生物工程有限公司,DHBP購于日本W(wǎng)ako和光純藥工業(yè)株式會社,細胞膜染料FM1-43購于北京海德生物技術有限公司,其他化學試劑購于太原市津海有限公司;恒溫震蕩培養(yǎng)箱2HWY-200D購于上海智城分析儀器制造有限公司,日立UV- 2010分光光度計購于Hitachi Instruments公司,高效液相色譜儀Waters 2487購于美國Waters公司,Delta Vision Deconvolution microscope購于美國Delta Vision公司,日立掃描電子顯微鏡SU1510購于Hitachi Instruments公司.

1.3 紅球菌R04細胞的共代謝

1.3.1 生物量測定及代謝分析,分別在10mmol/L聯(lián)苯中添加0,2,4和6mmol/L葡萄糖共同培養(yǎng). R04野生型,每隔4h取培養(yǎng)液測定OD600值.取培養(yǎng)液加入等體積色譜級甲醇,混勻后離心取上清即為總代謝物.另取培養(yǎng)液通過無菌紗布過濾除去聯(lián)苯顆粒后離心收集菌體,用磷酸緩沖液PBS(20mmol/L, pH 8.0)洗滌菌體,然后用等體積色譜級甲醇抽提,離心取上清即為胞內(nèi)代謝物.

將上述制備的待測樣品經(jīng)高效液相色譜儀分析[18],上樣量為10μL,采用外標法定量.該檢測過程使用C18色譜柱,流動相使用體積比9:1的甲醇與水混合液,流動相以1.0mL/min的速度洗脫,在254nm波長條件下檢測.

分別在基礎礦物培養(yǎng)基中添加聯(lián)苯,DHBP, HOPDA培養(yǎng)R04△A,R04△C,R04△D,并添加1/3葡萄糖(3.3mmol/L)提供碳源和能源維持細胞的生長,每隔4h取樣測定OD600值,繪制生長曲線.

1.3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,胞外代謝物等于總代謝物減去胞內(nèi)代謝物.生物量測定及代謝測定實驗均重復3次,以3次重復平均值作為最后結果.

1.4 熒光顯微鏡觀察

將10mmol/L的葡萄糖,聯(lián)苯,DHBP和HOPDA作為碳源培養(yǎng)紅球菌R04、代謝酶缺陷型紅球菌R04(培養(yǎng)時添加3.3mmol/L葡萄糖維持細胞生長)、大腸桿菌BL21、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌、紅酵母,培養(yǎng)至指數(shù)前期取適量菌液,8000r/ min離心5min收集菌體,PBS洗滌菌體2次;重懸后加入膜染料FM1-43(終濃度為0.1 μg/mL)避光染色5min;離心棄上清,PBS洗滌菌體2次,然后用適量PBS懸浮菌體.取上述染色菌液15μL制片,通過Delta Vision去卷積熒光顯微鏡觀察.

1.5 掃描電子顯微鏡觀察

6種微生物細胞培養(yǎng)至指數(shù)前期的方法同1.4,然后取適量菌液用2.5%戊二醛前固定,1%鋨酸后固定,乙醇逐級脫水,制片后置于60℃恒溫箱干燥,鍍膜,掃描電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài).

2 結果分析

2.1 紅球菌R04聯(lián)苯代謝分析

2.1.1 聯(lián)苯培養(yǎng)下紅球菌R04的代謝分析,為了研究在葡萄糖存在的情況下,紅球菌R04是否還會降解聯(lián)苯,本文用聯(lián)苯和不同濃度葡萄糖共同培養(yǎng). R04,結果顯示:添加葡萄糖后,. R04生長速率加快,但不會顯著提高其生物量(圖1a).添加葡萄糖并不會影響細胞對聯(lián)苯的代謝,4種培養(yǎng)條件下細胞外聯(lián)苯濃度均降低,細胞內(nèi)聯(lián)苯濃度呈現(xiàn)波動但整體為下降趨勢,且葡萄糖濃度對聯(lián)苯代謝速率影響不大(圖1b和c).表明葡萄糖存在時. R04仍會降解聯(lián)苯,該條件可以用于后續(xù)實驗.

G為葡萄糖,BP為聯(lián)苯

2.1.2 聯(lián)苯及其代謝物培養(yǎng)下代謝酶缺陷型紅球菌R04的生長,代謝酶缺陷型紅球菌R04不能利用聯(lián)苯及其代謝物產(chǎn)生能量供其生長,所以需要添加額外的碳源.本文用1/3葡萄糖和相應代謝物共同培養(yǎng)缺陷型. R04,發(fā)現(xiàn)細胞都可以生長,但是. R04△C細胞的生長量明顯低于. R04△A和. R04△D(圖2),說明聯(lián)苯代謝物DHBP對. R04△C的生長產(chǎn)生抑制作用.

圖2 缺陷型紅球菌R04生長曲線

2.2 聯(lián)苯及其代謝物對紅球菌R04分裂的抑制

圖3 紅球菌R04熒光顯微鏡圖

A-D, exponential phaseR04 wild type cultured with glucose, biphenyl, DHBP and HOPDA in basic mineral medium, respectively.

分別用10mmol/L的葡萄糖,聯(lián)苯,DHBP和HOPDA為碳源的基礎礦物培養(yǎng)基培養(yǎng)紅球菌R04,取指數(shù)前期細胞經(jīng)FM1-43染色后進行熒光顯微鏡觀察,如圖3所示.在葡萄糖和HOPDA為碳源培養(yǎng)條件下,可以觀察到. R04細胞膜清晰,形成完整的分裂隔膜(圖3A和D);聯(lián)苯培養(yǎng)的. R04細胞分裂隔膜不完整,細胞質中有熒光斑點形成(圖3B);而DHBP培養(yǎng)的. R04細胞邊界模糊,細胞膜熒光強度基本與細胞質相同,大量熒光斑點聚集在細胞質中,看不到完整的分裂隔膜(圖3C).SEM結果顯示,聯(lián)苯培養(yǎng)的細胞(圖4B)端部或一側出現(xiàn)腫脹小結,圖中紅色箭頭指示細胞出現(xiàn)腫脹小結的位置;而生長于葡萄糖中的細胞(圖4A)正常分裂.. R04在代謝聯(lián)苯的過程中會生成代謝物DHBP,所以推測DHBP影響了. R04細胞分裂隔膜的形成,進而影響細胞的正常分裂.

A and B exponential phaseR04wild type cultured with glucose and BP, respectively

圖5 紅球菌R04熒光顯微鏡圖

A-D, exponential phaseR04 wild type cultured with glucose, biphenyl, DHBP and HOPDA in LB medium, respectively

分別用含10mmol/L的葡萄糖,聯(lián)苯,DHBP和HOPDA的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)紅球菌R04,取指數(shù)前期細胞經(jīng)FM1-43染色后進行熒光顯微鏡觀察,如圖5所示.在LB和HOPDA(圖5A和D)培養(yǎng)條件下,可以觀察到. R04細胞膜清晰完整,能形成完整的分裂隔膜,而添加聯(lián)苯(圖5B)后,細胞質中有熒光斑點產(chǎn)生;而DHBP處理后的. R04細胞(圖5C)膜熒光強度著色不均,無法形成完整的分裂隔膜.所以推測無論在基礎培養(yǎng)基中還是LB培養(yǎng)基中,添加聯(lián)苯代謝物DHBP都會影響. R04細胞的分裂.

2.3 聯(lián)苯及其代謝物對代謝酶缺陷型R. R04分裂的抑制

圖6 缺陷型紅球菌R04熒光顯微鏡圖

A and B, exponential phase. R04 △A cells cultured with glucose and biphenyl. C and D, exponential phase. R04 △C cells cultured with glucose and DHBP. E and F, exponential phase. R04△D cells cultured with glucose and HOPDA

為了進一步研究是哪種物質影響了紅球菌R04細胞分裂隔膜的形成,本文用相應的代謝物培養(yǎng)紅球菌R04缺陷型(同時加入葡萄糖保持細胞生長),取指數(shù)前期細胞經(jīng)FM1-43染色后進行熒光顯微鏡觀察.由圖6可看出,用聯(lián)苯培養(yǎng). R04△A(圖6B)和用HOPDA培養(yǎng). R04△D(圖6F)與用葡萄糖培養(yǎng)相比(圖6A和E),. R04△A和. R04△D細胞分裂隔膜清晰可見,能進行正常分裂.而DHBP培養(yǎng). R04△C(圖6D)與葡萄糖培養(yǎng)(圖6C)相比差別很大,細胞邊界模糊不清,細胞膜與細胞質著色程度相同,看不到清晰完整的分裂隔膜,細胞質中有熒光斑點形成.經(jīng)過SEM觀察得出,葡萄糖培養(yǎng)的. R04△A(圖7A)和HOPDA培養(yǎng)的. R04△D(圖7D)細胞表現(xiàn)正常;當用聯(lián)苯培養(yǎng). R04△A(圖7B)時,有個別細胞端部或一側出現(xiàn)腫脹小結,而用DHBP培養(yǎng). R04△C(圖7C)時,出現(xiàn)腫脹小結的細胞數(shù)量增多,圖中紅色箭頭指示細胞出現(xiàn)腫脹小結的位置.結果表明DHBP為主要影響. R04細胞分裂隔膜形成的物質,進而影響細胞的正常分裂.

A and B, exponential phase. R04△A cultured with glucose and biphenyl. C, exponential phase. R04△C cultured glucose and DHBP. D, exponential phase. R04△D cultured glucose and HOPDA. E, partial enlarged view of C

為了進一步研究DHBP對. R04△C的影響,我們選取0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1mmol/L DHBP去處理. R04△C細胞,并添加1/3葡萄糖維持. R04△C的生長,取指數(shù)前期細胞經(jīng)FM1-43染色后進行熒光顯微鏡觀察,結果如圖8所示:在葡萄糖培養(yǎng)條件下細胞分裂隔膜完整,清晰可見(圖8A);在0.01mmol/L DHBP作用下細胞內(nèi)開始出現(xiàn)粘附的熒光斑點(圖8B),隨著DHBP濃度的增大,熒光斑點增多,細胞絲狀化明顯,說明低濃度DHBP也導致細胞不能形成完整的分裂隔膜,影響細胞的正常分裂.

圖8 R. R04△C熒光顯微鏡圖

A, exponential phase. R04△C cultured with glucose. B~F,exponential phase. R04△C cultured with glucose and 0.01、0.03、0.05、0.1、0.3mmol/L DHBP, respectively

2.4 聯(lián)苯及其代謝物對其它微生物細胞分裂的影響

2.4.1 聯(lián)苯及其代謝物對大腸桿菌BL21分裂的影響,選擇革蘭氏陰性細菌的代表大腸桿菌作為研究對象,分別在LB液體培養(yǎng)基中添加10mmol/L聯(lián)苯,DHBP和HOPDA培養(yǎng)大腸桿菌,取指數(shù)前期細胞經(jīng)FM1-43染色后進行熒光顯微鏡觀察.如圖9所示,在所有培養(yǎng)條件下大腸桿菌細胞膜著色明顯,能看到清晰并完整的分裂隔膜,但DHBP培養(yǎng)的細胞(圖9C)體積明顯小于其它3種情況.通過SEM圖可看出,生長于LB和聯(lián)苯培養(yǎng)基中的大腸桿菌(圖9E和F)形態(tài)完整,為短桿狀,能明顯看出二分裂的生殖方式;經(jīng)DHBP處理后,細胞(圖9G)生長受到嚴重阻滯,細胞發(fā)生凹陷,胞質內(nèi)容物流失,但細胞膜相對完整,這種結果的產(chǎn)生機制目前尚不清楚,需要進行更深入的研究.

2.4.2 聯(lián)苯及其代謝物對枯草芽孢桿菌WB600分裂的影響,選擇革蘭氏陽性細菌枯草芽孢桿菌WB600作為研究對象,分別在LB液體培養(yǎng)基中添加10mmol/L聯(lián)苯,DHBP培養(yǎng)枯草芽孢桿菌,取指數(shù)前期細胞經(jīng)FM1-43染色后進行熒光顯微鏡觀察,如圖10所示.對照組中的枯草芽孢桿菌(圖10A)分裂正常,能形成完整的分裂隔膜;用聯(lián)苯處理后枯草芽孢桿菌(圖10B)部分細胞發(fā)生絲狀化,比正常細胞長約2~3倍;而用DHBP處理后細胞(圖10C)體積明顯縮小,生長緩慢,而且不能形成完整的分裂隔膜.通過SEM圖10也證明了這一結論.

E-G: Scanning electron micrograph ofBL21, exponential phase cells cultured with LB, biphenyl, DHBP, respectively

2.4.3 聯(lián)苯及其代謝物對金黃色葡萄球菌分裂的影響,選擇金黃色葡萄球菌作為研究對象,分別在LB液體培養(yǎng)基中添加10mmol/L聯(lián)苯,DHBP培養(yǎng)金黃色葡萄球菌,取指數(shù)前期細胞經(jīng)FM1-43染色后進行熒光顯微鏡觀察如圖11所示.對照組(圖11A)和聯(lián)苯培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌(圖11B)細胞膜著色明顯,形成完整分裂隔膜的細胞較多,而用DHBP處理后的細胞(圖11C)幾乎不能形成分裂隔膜,表明DHBP影響金黃色葡萄球菌的生長和分裂.SEM圖結果顯示:用DHBP處理過的金黃色葡萄球菌(圖11F)有些細胞從球狀變成了不規(guī)則的啞鈴狀;對照組(圖11D)和聯(lián)苯(圖11E)處理的金黃色葡萄球菌能形成完整的分裂隔膜,細胞能正常分裂.圖11D和E紅色箭頭指示的橢球狀細胞表示能形成完整分裂隔膜,即將進行細胞分裂.

D-F: Scanning electron micrograph ofWB600, exponential phase cells cultured with LB, biphenyl, and DHBP, respectively

D-F: Scanning electron micrograph of, exponential phase cellswith LB, biphenyl, and DHBP, respectively

2.4.4 聯(lián)苯及其代謝物對紅酵母分裂的影響,選擇紅酵母作為真菌研究對象,分別在YPD液體培養(yǎng)基中添加10mmol/L聯(lián)苯,DHBP培養(yǎng)紅酵母,取指數(shù)前期細胞制片后進行熒光顯微鏡觀察.結果顯示對照組中紅酵母(圖12A)出芽生殖的細胞較多,而用DHBP處理過的紅酵母(圖12C)出芽生殖的比例明顯降低,大部分以單個細胞形式存在,生長于聯(lián)苯中的細胞(圖12B)多以3~4個細胞的聚集狀態(tài)形式存在.通過SEM圖也觀察到這一現(xiàn)象.我們通過統(tǒng)計200個紅酵母細胞來說明DHBP對細胞出芽率的影響,統(tǒng)計結果顯示:對照組中出芽生殖的細胞比例為64.2%,而未出芽的細胞比例為35.8%;實驗組DHBP處理過的細胞出芽生殖比例降低為19.3%,未出芽的細胞比例為80.7%,說明DHBP影響了紅酵母的生長和繁殖.

D-F: Scanning electron micrograph of, exponential phase cells cultured with YPD, biphenyl, and DHBP, respectively

表1 DHBP對不同微生物細胞形態(tài)和分裂的影響

注:+越多,表示DHBP對細胞影響越大.

綜上結果可以看出,DHBP對不同微生物細胞影響不同,如表1和表2所示DHBP對大腸桿菌BL21影響作用最大,導致96.4%的細胞表面凹陷,胞質內(nèi)容物流失,菌體體積縮小;對. R04和枯草芽孢桿菌WB600細胞影響次之,導致. R04和缺陷型. R04細胞形成不完整隔膜的比例增加,導致枯草芽孢桿菌89.6%的細胞體積明顯縮小,同時無法形成完整的分裂隔膜;對金黃色葡萄球菌、紅酵母影響作用最小,導致金黃色葡萄球菌基本沒有細胞形成完整的分裂隔膜;導致紅酵母細胞能進行出芽生殖的比例從64.2%降低到19.3%,但對其細胞形態(tài)無明顯改變.

表2 聯(lián)苯及其代謝物對不同微生物細胞形態(tài)和分裂的影響

注:對金黃色葡萄球菌的影響統(tǒng)計結果表示的是能形成完整分裂隔膜的細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比例;對紅酵母的影響統(tǒng)計結果表示的是能進行出芽生殖的細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比例;對其他微生物細胞的影響統(tǒng)計結果均表示異常細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比例.

3 討論

目前,國內(nèi)外學者對芳香化合物的降解主要研究前體物質對微生物的影響,很少有人研究代謝物對微生物細胞生長和分裂的影響,Yamada等[19]研究報道當向培養(yǎng)物中加入2-羥基聯(lián)苯或3-羥基聯(lián)苯后,MV1184,PpY101和PA01細胞的分裂受到抑制,導致細菌細胞絲狀化; Mizukami-Murata等[20]研究表明低取代氯PCBs能夠抑制PC12細胞神經(jīng)元的伸長;Subramanian等[21]也發(fā)現(xiàn),雖然母體多氯聯(lián)苯和高取代氯的OH-PCBs表現(xiàn)出較低或不可檢測的毒性,但低取代氯的OH-PCBs顯著抑制了擬南芥的發(fā)芽率和植物生長.這些研究僅僅是證明了聯(lián)苯/PCBs的某種衍生物對有機體的影響,沒有完整的分析聯(lián)苯/PCBs一系列的代謝物對有機體的影響.本文為了確定聯(lián)苯培養(yǎng)紅球菌R04過程中具體是哪種代謝物影響了紅球菌R04細胞的分裂和形態(tài),分別用聯(lián)苯及其代謝物DHBP和HOPDA培養(yǎng)R04、相應代謝酶缺陷型R04,通過熒光顯微鏡、掃描電子顯微鏡觀察細胞的分裂情況和形態(tài)變化.結果發(fā)現(xiàn)與其它代謝物培養(yǎng)相比,DHBP培養(yǎng)的R04和缺陷型細胞膜邊界模糊,看不到清晰完整的細胞分裂隔膜,只觀察到細胞質中粘附的熒光斑點,掃描電子顯微鏡觀察到DHBP培養(yǎng)的細胞在分裂過程中細胞一側或端部形成腫脹的小結,影響了R04的正常分裂.其次本文還用聯(lián)苯及其代謝物作用了其它的微生物細胞:大腸桿菌BL21、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌、紅酵母,結果顯示與對照組、聯(lián)苯、HOPDA條件培養(yǎng)下的細胞相比,DHBP處理過的細胞發(fā)生不同程度的異常變化,導致細胞無法正常分裂,可見DHBP是主要影響細胞形態(tài)和分裂隔膜形成的物質.當在基礎礦物培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中添加聯(lián)苯及其代謝物時細胞表現(xiàn)出類似的分裂情況，結果顯示代謝物DHBP的毒害作用大于聯(lián)苯和HOPDA,聯(lián)苯培養(yǎng)下細胞質中有熒光斑點產(chǎn)生，推測是由于紅球菌R04將聯(lián)苯代謝為DHBP的結果，其聯(lián)苯自身的毒害性小于DHBP.

從化學結構式來看,聯(lián)苯代謝物DHBP苯環(huán)上有兩個相鄰的羥基,而HOPDA苯環(huán)上含有一個羥基和一個羧基.Wang等[22]研究結果表示,影響取代芳烴化合物毒性的主要影響因素是分子量,分子量越大,化合物越穩(wěn)定,化合物的脂溶性越好,毒性越強.同時,苯環(huán)上羥基的引入可增強與生物體內(nèi)受體堿性基團的結合能力,導致活性和毒性的增高[23].許多研究也認為氫鍵結合是毒物與受體之間的主要作用方式之一,化合物毒性越大,在結構中可以發(fā)現(xiàn)更多的氫鍵供體和受體[24].本文研究的DHBP和HOPDA苯環(huán)上的取代基可能參與氫鍵的生成,因此推測DHBP造成細胞分裂過程中的異常行為可能與其苯環(huán)上兩個羥基的存在以及氫鍵結合的能力有很大相關關系.

芬頓氧化技術作為一種具有高效、廉價、選擇性小等特點的高級氧化技術應用于環(huán)境污染處理領域[25],特別是對于難以氧化的芳香類化合物及一些雜環(huán)類化合物,能夠很好的降解.本研究用DHBP處理細胞時,基礎礦物培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基中都避免不了含有亞鐵離子,培養(yǎng)過程中與DHBP苯環(huán)上所帶有的羥基基團發(fā)生芬頓反應,培養(yǎng)基與菌體顏色最終變?yōu)楹谏?其過程氧化掉一部分2,3-羥基聯(lián)苯,所以推測能夠進入細胞內(nèi)并對細胞產(chǎn)生毒害作用的2,3-羥基聯(lián)苯的量是微小的,但微量的DHBP仍導致使細胞無法形成完整的分裂隔膜,影響細胞的正常分裂.同時為了驗證低濃度的DHBP能抑制細胞的分裂和生長,在0~1mmol/L DHBP之間選取適合濃度去處理. R04DC細胞,發(fā)現(xiàn)0.01mmol/L DHBP作用下細胞內(nèi)開始出現(xiàn)粘附的熒光斑點,隨著DHBP濃度的增大,熒光斑點增多,而且培養(yǎng)基和菌體不會變黑色,說明低濃度的DHBP確實對細胞有毒害作用.所以推測當用10mmol/L的DHBP處理細胞時培養(yǎng)基和菌體顏色變黑的原因有可能是DHBP的濃度太高所致的.

根據(jù)革蘭氏染色法原理將細菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌,革蘭氏陽性細菌的細胞壁厚,肽聚糖含量豐富,而革蘭氏陰性細菌的細胞壁肽聚糖層薄,交聯(lián)松散,但其脂類含量高.細菌細胞壁結構的顯著不同,導致這兩類細菌在染色性、抗原性、毒性、對某些藥物的敏感性等方面存在很大差異[26].本研究中用DHBP處理革蘭氏陽性細菌:紅球菌R04、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌時,使紅球菌細胞無法形成完整的分裂隔膜,在熒光顯微鏡下觀察到一些粘附的熒光斑點,掃描電子顯微鏡下也觀察到細胞一側或端部出現(xiàn)腫脹的小結,導致細胞分裂異常;用DHBP處理枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌時導致枯草芽孢桿菌細胞體積明顯縮小,導致金黃色葡萄球菌形成分裂隔膜的細胞減少,掃描電子顯微鏡下觀察到有些細胞形狀變?yōu)閱♀彔?而用DHBP處理陰性菌大腸桿菌BL21時,大腸桿菌生長阻滯,細胞體積縮小,分裂受到抑制,掃描電子顯微鏡下觀察到大腸桿菌細胞表面凹陷,胞質內(nèi)容物流失.可以說明DHBP對革蘭氏陰性細菌的影響比對陽性細菌的影響作用大.有研究結果顯示,加入1g/L山梨酸鉀后革蘭氏陰性菌的菌數(shù)可減少近102~103.5CFU/mL,而革蘭氏陽性菌的菌數(shù)只能減少近10CFU/mL,說明山梨酸鉀對革蘭氏陰性菌的抑菌效果比革蘭氏陽性菌要高2倍以上.山梨酸鉀具有親脂性,革蘭氏陰性菌的細胞壁脂類物質含量較高,因此山梨酸鉀分子易通過;革蘭氏陽性菌的細胞壁則含有大量肽聚糖,不易通過[27]. Rundegren等[28]研究中,G-細菌經(jīng)6.4mmol/L Delmopinol處理后,其胞壁超微結構及細胞外形均出現(xiàn)很明顯的改變,大量囊泡和膜連接物質被釋放出細胞外,而經(jīng)同樣方法處理的G+細菌胞壁則無明顯變化,10min后僅部分細胞周圍有球形小顆粒出現(xiàn).2,3-二羥基聯(lián)苯不溶于水,易溶于醇、丙酮等有機溶劑,具有親脂性,所以我們推測革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌細胞壁的結構不同可能是造成2,3-二羥基聯(lián)苯對兩類細菌影響差異的主要原因.然而聯(lián)苯及其中間代謝物影響細胞生長分裂的分子機制還有待進一步研 究.

4 結論

4.1 添加葡萄糖不會影響紅球菌R04對聯(lián)苯的代謝,培養(yǎng)過程中細胞外聯(lián)苯濃度均降低,細胞內(nèi)聯(lián)苯濃度呈現(xiàn)波動但整體為下降趨勢.

4.2 2,3-二羥基聯(lián)苯對紅球菌R04及其它幾種模式菌株都具有較強的抑制作用,影響細胞的正常形態(tài)和分裂增殖,導致紅球菌R04端部腫脹,大腸桿菌BL21細胞內(nèi)陷,胞質內(nèi)容物流失,導致枯草芽孢桿菌WB600體積縮小,金黃色葡萄球菌無法形成正常的分裂隔膜,并導致酵母的出芽生殖比例從64.2%降低到19.3%,表明2,3-二羥基聯(lián)苯對革蘭氏陰性菌的毒性效應大于革蘭氏陽性菌.

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致謝：感謝導師楊秀清老師以及師姐商慧慧提供的幫助與支持,在此表示由衷感謝.

Growth stress and division inhibition of biphenyl metabolism on microorganisms.

YANG Xiu-qing*, LIU Ya-ni

(Instiute of Biotechnology, Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)., 2019,39(9)：3941~3950

The biphenyl/polychlorinated biphenyl degrading strain R04 (sp. R04) and several model microorganisms were used as the research objects. Cell division and morphological changes of biphenyl/polychlorinated biphenyl degrading strain R04 were analyzed by high performance liquid chromatography, fluorescence microscopy and scanning electron microscopy under the conditions of biphenyl and its metabolites culture. The results showed that the division ofsp. R04 and several model microbial cells were inhibited under biphenyl and its metabolites culture conditions, and some microbial cells morphology were affected. Compared with the precursor-biphenyl and its metabolite 2-hydroxy-6-keto-6-phenyl-2, 4-hexadienoic acid, 2,3-dihydroxybenzene has stronger inhibition and morphological change on G+, G-bacteria orcell division. The proportion of.R04 cells and defective.R04 cells forming incomplete septum was increased under the condition of 2,3-dihydroxybenzene culture. It caused that 96.4% ofBL21 cells surface was dented, cytoplasmic content was lost and bacterial body volume was shrunk. It caused that 89.6% ofcells was shrunk significantly. The phenomenon thathas almost no cells to form a complete septum was caused. The percentage ofcells that could germinate and reproduce was decreased from 64.2% to 19.3%, but there was no significant change in cell morphology. Biphenyl metabolite 2,3-dihydroxybiphenyl has strongly inhibitory effect on cell division and proliferation ofsp. R04 and other microorganisms than its precursor-biphenyl, and it is suggested that the toxic effect of environmental compounds metabolism should be considered when the interaction between environmental compounds and microorganisms.

biphenyl metabolism；sp. R04；cell division；environmental compounds

X703.5

A

1000-6923(2019)09-3941-10

楊秀清(1975-),男,山西代縣人,副教授,博士,主要從事微生物生物轉化與生物催化研究.發(fā)表論文50余篇.

2019-02-21

山西省自然科學基金資助項目(2014011030-3);山西省煤層氣聯(lián)合研究基金資助項目(2015012002);山西省煤基重點科技攻關項目(MQ2014-03)

* 責任作者, 副教授, xiuqyang@sxu.edu.cn