人乳頭瘤病毒檢測方法及其應(yīng)用進(jìn)展

彭彩姣　熊正愛

[摘要] 宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，早發(fā)現(xiàn)、早治療是預(yù)防宮頸癌的關(guān)鍵。除細(xì)胞學(xué)檢查外，HPV檢測也是宮頸癌篩查的重要方法。最初的HPV檢測方法主要是基于形態(tài)學(xué)，如細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)、免疫組化及電鏡等，但因敏感度和特異度均不理想，操作較繁瑣，臨床使用較少。目前應(yīng)用于臨床的HPV檢測方法為基于現(xiàn)代分子生物學(xué)的核酸技術(shù)，靈敏度及特異度均較高。該文就國內(nèi)、外普遍應(yīng)用的HPV檢測方法及其應(yīng)用進(jìn)展作一簡述。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌;宮頸上皮內(nèi)瘤變;人乳頭瘤病毒;檢測

[中圖分類號] R737? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）07（a）-0196-03

Progress in Detection of Human Papillomavirus and Its Application

PENG Cai-jiao， XIONG Zheng-ai

The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing， 400010 China

[Abstract] Cervical cancer is a common malignant tumor in women. Early detection and early treatment are the key to prevent cervical cancer. In addition to cytology， HPV testing is also an important method for cervical cancer screening. The original HPV detection method is mainly based on morphology， such as cytology， histology， immunohistochemistry and electron microscopy， but the sensitivity and specificity are not ideal， the operation is cumbersome， and the clinical applications are fewer. The current HPV detection method applied to the clinic is based on modern molecular biology nucleic acid technology， and the sensitivity and specificity are high. This paper gives a brief introduction to the domestic and foreign HPV detection methods and their application progress.

[Key words] Cervical cancer; Cervical intraepithelial neoplasia; Human papillomavirus; Detection

目前宮頸癌仍嚴(yán)重威脅全球女性的生命健康，仍是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1]，世界范圍內(nèi)宮頸癌居女性惡性腫瘤第4[2]，每年約有50萬的新發(fā)病例，每年死亡病例超過26萬，均主要發(fā)生于社會經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)[3]。隨著宮頸癌細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合HPV檢測的篩查模式的推廣及逐漸普及，全球?qū)m頸癌的死亡率和發(fā)生率下降明顯，但在發(fā)展中國家尤其是中低收入國家有上升趨勢，數(shù)據(jù)顯示我國則有逐漸上升[4]。

長期以來宮頸癌篩查以細(xì)胞學(xué)檢查為主，隨著HPV感染和宮頸腫瘤之間的直接因果關(guān)系被證實[5-7]，HPV檢測逐漸成為宮頸癌的重要部分。HPV檢測雖特異性較低，但高敏感性、高陰性預(yù)測值等特點(diǎn)更突出，近期研究提出，聯(lián)合篩查在預(yù)防宮頸癌發(fā)揮的重大意義可能在于HPV檢測[8]，HPV檢測在預(yù)防宮頸癌方面可提供更多的保護(hù)[9]。該文將對以下HPV檢測方法及其應(yīng)用進(jìn)展作一簡述。

1? HPV DNA檢測

1.1? 雜交捕獲（Hybrid Capture，HC）技術(shù)

HC-II技術(shù)1999年成為美國FDA認(rèn)證的第一個用于宮頸癌篩查的HPV檢測方法，基因雜交基礎(chǔ)上利用化學(xué)發(fā)光對抗體捕獲的信號放大原理，對高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型進(jìn)行檢測，并可進(jìn)行病毒載量半定量檢測，因有統(tǒng)一的臨床判定標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果客觀性較高，且重復(fù)性好，采用HPV全長堿基對設(shè)計避免了因靈敏度過高導(dǎo)致的假陽性，無需基因擴(kuò)增有效避免環(huán)境因素造成的假陰性。研究顯示HC-II法對CIN2及以上病變的敏感度及特異度分別為97.1%和85.6%[10]，因此HC-II法至今被作為HPV檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法不能具體分型、缺乏內(nèi)質(zhì)控，且成本高，與低危型HPV型也存在交叉反應(yīng)[10-11]。

careHPV檢測是一種宮頸癌快速篩查技術(shù)，2018年8月獲世界衛(wèi)生組織資格認(rèn)證。careHPV檢測同樣基于HC-II的原理，但除能檢測常見13種高危型HPV外，還能檢測HPV 66型，且操作簡易、價格低廉、檢測用時短，因此，該方法被認(rèn)為非常適用于衛(wèi)生資源匱乏地區(qū)等發(fā)展中國家，包括中國農(nóng)村。臨床結(jié)果顯示，CcareHPV對CIN2及以上病變的靈敏度為90%，特異度為84.2%，與HC-II檢測接近[12]。

1.2? Invader 酶切信號放大法

該方法采用Invader專利技術(shù)，通過分子雜交和化學(xué)信號放大，直接檢測特定HPV DNA序列。2009年美國FDA批準(zhǔn)使用的Cervista HPV檢測則基于該方法，對HPV DNA的L1、E6/E7區(qū)進(jìn)行檢測，這可避免僅檢測L1區(qū)所造成的假陰性，且與多數(shù)低危型HPV無交叉反應(yīng)，降低了假陽性率[13]，也能進(jìn)行內(nèi)質(zhì)控，其有兩種試劑盒：Cervista HR HPV和Cervista HPV16/18，前者能檢測14種高危型HPV，并將其分為A5/6、A7、A9 3組，但認(rèn)為分組檢測的臨床意義尚不能明確[14]，后者可對HPV16/18分型。Belinson等在中國廣東省納入1萬女性的研究中Cervista HR HPV對CIN3及以上病變的靈敏度為95.1%（95%，90%～98%），與HC-II法無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，但特異度顯著高于HC-II法（P<0.05）[15]。

1.3? 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)

這類方法多樣，包括常規(guī)PCR技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)、PCR-酶聯(lián)免疫吸附測定檢測技術(shù)、PCR結(jié)合返向雜交技術(shù)等。2011年獲FDA批準(zhǔn)用于宮頸癌篩查的Cobas 4800 HPV檢測則以實時熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，可檢測14種高危型HPV，并提供HPV16、18同步基因分型，但對余12種不能具體分型，敏感性和特異性均較高，且不存在與低危型HPV的交叉反應(yīng)，但因敏感性過高，易導(dǎo)致假陽性率的增加。Mark等[16]的研究顯示，Cobas 4800 HPV檢測在靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值方面與HC-II法無明顯差異，且兩者一致性高，在CIN2以下和CIN2及以上的病變中的一致性分別為90.6%（95%，89.1%～92%）和96.2%（95%，89.5%～98.7%）。Lapierre等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Cobas 4800 HPV檢測的重復(fù)性較好，多次檢測的一致率較高，降低了操作成本，同時能對是否行陰道鏡下活檢提供有效幫助信息?；贏THENA的研究結(jié)果[18]，2014年Cobas 4800 HPV檢測成為美國FDA唯一批準(zhǔn)用于25歲女性宮頸癌一線初篩的HPV 檢測方法。隨著國內(nèi)外學(xué)者深入探索，發(fā)現(xiàn)HPV自取樣技術(shù)的參與率高于細(xì)胞學(xué)篩查，群眾可接受度更高[19]，HPV自取樣或許可作為宮頸癌初篩手段[20]，且應(yīng)用基于PCR 的HPV檢測方法進(jìn)行自取樣標(biāo)本可獲得與醫(yī)生取材一樣的敏感性[21-22]，因此有學(xué)者認(rèn)為Cobas HPV檢測技術(shù)也可用于HPV自取樣。

目前在中國廣泛使用的HPV基因分型檢測結(jié)合PCR技術(shù)、導(dǎo)流雜交及基因芯片技術(shù)為一體，可同時檢測21種HPV基因型別，包括13種常見的高危型HPV、5種低危型HPV（6、 11、42、 43、 44、81型）和中國人常見基因型（HPV53、66、81型），并具體分型，判斷多重感染[23]。

今年美國FDA批準(zhǔn)的BD Onclarity HPV 檢測系統(tǒng)，同樣基于PCR技術(shù)。大多數(shù)HPV檢測方法針對的是HPV基因組L1區(qū)，而該方法針對E6/E7 DNA 癌基因，其中樣品處理、核酸提取、即時PCR擴(kuò)增、檢測以及結(jié)果報告均為自動化處理，同樣可檢測14種高危型HPV，但其報告為：6種高危型HPV（16、18、31、45、51和52型）為獨(dú)立結(jié)果和其余8種高危型HPV另分為三個獨(dú)立報告：（33、58型）、（35、39、68型）和（56、59、66型），可降低人為干預(yù)，大幅度提高實驗室的工作效率。

2? HPV mRNA檢測

該方法利用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫擴(kuò)張技術(shù)，提取HPV E6/E7mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，分別對16型、18/45型和其他11種高危型HPV進(jìn)行檢測。研究數(shù)據(jù)顯示該方法既具備HPV DNA的敏感性，又有與細(xì)胞學(xué)檢查相似的特異性[24]，能較好平衡HPV檢測的敏感性和特異性，同時可降低傳統(tǒng)HPV DNA檢測對于一過性HPV感染的檢出率。E6/E7為HPV的致癌基因，在大量HPV持續(xù)被轉(zhuǎn)錄為E6/E7 mRNA ，表達(dá)大量癌蛋白時，可增加細(xì)胞惡變的風(fēng)險[25-26]，因此較HPV DNA檢測，HPV mRNA檢測或許更能發(fā)現(xiàn)具有臨床意義的HPV感染[27]，真正識別高風(fēng)險的宮頸癌前病變?nèi)巳篬28]。Aptima HPV檢測即為一種HPV mRNA檢測，包括Aptima HPV和Aptima HPV16/18/45 Genotype，后者可對前者陽性結(jié)果進(jìn)一步分型，兩者均在2011年獲得美國FDA批準(zhǔn)。但該方法同樣缺乏內(nèi)質(zhì)控，不能具體分型，也可能與低危型HPV有交叉感染。

3? 結(jié)語

宮頸癌篩查的目的在于盡可能識別出真正的癌前病變，避免對HPV一過性感染的過度檢查及過渡治療。HPV檢測作為作為宮頸癌的重要篩查手段，基于HPV檢測的優(yōu)勢，在發(fā)展中國家，尤其是經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)可能有更高的應(yīng)用前景，若合理利用，將對全球的宮頸癌防控產(chǎn)生重大意義。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 劉萍.中國大陸13年宮頸癌臨床流行病學(xué)大數(shù)據(jù)評價[J]. 中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2018，34（1）：41-45.

[2]? Bray F，F(xiàn)erlay J，Soerjomataram I，et al.Global Cancer Statistics 2018： GLOBOCAN Estimates Of Incidence And Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries[J].CA Cancer J Clin，2018：1-31.

[3]? Tsu V，Jerónimo J.Saving the World's women from cervical cancer[J].New Engl J Med，2016，374（26）：2509.

[4]? Chen WQ，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer Statistics in China 2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[5]? Smith JS，Lindsay L，Hoots B，et al.Human Papillomavirus Type Distribution In Invasive Cervical Cancer And High-grade Cervical Lesions： A meta-analysis update[J].Int J Cancer， 2007（121）：621-632.

[6]? Stensen S，Kjaer SK，Jensen SM，et al.Factors Associated With Type-specific Persistence Of High-risk Human Papill omavirus Infection： A population-based study[J].Int J Cancer，2016，138（2）：361-368.

[7]? Yang Y，Ren J，Zhang Q.Distribution of human papilloma virus type 16E/E7 gene mutation in cervical precanceror cancer：a case control study in Guizhou Province，China[J].J Med Vinrol，2016，88（2）：345-350.

[8]? Gage J，Katki HA，Schiffman M，et al.Reassurance Against Future Risk of Precancer and Cancer Conferred by a Negative Human Papillomavirus Test[J].J Natl Cancer Inst，2014，106（8）：1-4.

[9]? Ronco G，Dillner J，Elfstrom KM，et al.Efficacy of HPV-based screening for prevention of invasive cervical cancer： follow-up of four European randomised controlled trials[J].Lancet，2014，383（9916）：524-532.

[10]? 吳文湘，劉朝暉.62種人乳頭瘤病毒臨床檢測技術(shù)點(diǎn)評[J].中國計劃生育和婦產(chǎn)科，2016，8（9）： 1-3.

[11]? Clavel C，Masure M，Bory JP，et al.Hybrid Capture II-based Human Papillomavirus Detection，a Sensitive Test Todetect In Routine High-grade Cervical Lesions： A preliminary study on 1518 women[J]. Br J Cancer，1999， 80（9）：1306-1311.

[12]? Qiao YL，Sellors JW，Eder PS，et al.A new HPV-DNA test for cervical-cancer screening in developing regions：a cross-sectional study of clinical accuracy in rural China[J].Lancet Oncol，2008，9（10）：929-936.

[13]? 呂攀攀，邢志芳.人乳頭瘤病毒實驗室檢測方法的研究進(jìn)展[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2017，38（5）： 660-664.

[14]? 魏麗惠.下生生殖道上皮內(nèi)病變的診治和管理[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2018：43.

[15]? Belinson JL，Wu R，Belinson SE，et al.A population-base clinical trial comparing endocervical high-risk HPV testing using Hybrid Capture 2 and cervista from the SHENCCAST II study[J].Am J Alin Pathol，2011（13）：790-795.

[16]? Mark H，Stoler MD，Wright TC，et al.High-risk Human Papillomavirus Testing In Women With ASC-US Cytology：Tesults From the ATHENA HPV study[J].Am J Clin Pathol，2011，135（3）：468-475.

[17]? Lapierre SG，Sauthier P，Mayrand MH，et al.Human papillo mavirus （HPV） DNA Triage Of Women With Atypical Squamous Cells Of Undetermined Significance with cobas 4800 HPV and Hybrid Capture 2 tests for detection of high-grade lesions of the uterine cervix[J].J Clin Microbiol，2012，50（4）：1240-1244.

[18]? Wright TC，Stoler MH，Behrens CM，et al.Primary Cervical Cancer Screening With Human Papillomavirus：End Of Study Results From The ATHENA Study Using HPV As the First-line Screening Test[J].Gynecol Oncol，2015，136（2）：189-197.

[19]? Racey CS，Withrow DR，Gesink D，et al.Self-collected HPV testing improves participation in cervical cancer screening： a systematic review and meta-analysis[J].Can J Public Health，2013，104（2）： e159-166.

[20]? Arbyn M，Castle PE.Offering self-sampling kits for HPV testing to reach women who do not attend in the regular cervical cancer screening program[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2015（24）：769-772.

[21]? Arbyn M，Verdoodt F，Snijders PJF，et al.Accuracy Of Human Papillomavirus Testing On Self-collected Versus Clinician-collected Samples： A meta-analysis[J].Lancet Oncol，2014， 15 （2）：172-183.

[22]? Arbyn M，Smith SB，Temin S，et al.Detecting cervical precan- cer and reaching underscreened women by using HPV testing on self samples： updated meta-analyses[J].BMJ，2018（363）：k4823.

[23]? Tao P，Zheng W，Wang Y， et al.Sensitive HPV genotyping based on the flow-through hybridization and gene chip[J].J Biomed Biotechnol，2012（2012）：938780.

[24]? Cuschieri K，Wentzensen N.Human Papillomavirus mRNA and p16 Detection as Biomarkers for the Improved Diagnosis of Cervical Neoplasia[J].Cancer Epidemiol Prev，2008;17 （10）：2536-2545.

[25]? Lu X，Lin M.Multiple-integratinos Of HPV16 Genome And Altered Transcription of Viral Oncngenesdan Cellular Genes Are Associated Weith The Development of Cerveical Cancer[J].Plos One，2014，9（7）：75-88.

[26]? Gustinucci D， Giorgi Rossi P， Cesarini E，et al.Use of Cytology，E6/E7 mRNA，and p16INK4a-Ki-67 to Define the Management of Human Papillomavirus（HPV）-Positive Women in Cervical Cancer Screening[J].Am J Clin Pathol，2016，145（1）：35-45.

[27]? Arbyn M，Roelens J，Cuschieri K，et al.The APTIMA HPV Assay Versus the Hybrid Capture 2 Test in Triage of Women With ASC-US or LSIL Cervical Cytology：A meta-analysis of the Diagnostic Accduracy[J].Int J Cancer，2012， 132 （1）：101-108.

[28]? 陳露露，陳汝. 子宮頸癌篩查技術(shù)新進(jìn)展[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志，2015，50（4）：312-314.