冷鮮牛肉貯藏中菌群結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢菌致腐性的分析

顧春濤，畢偉偉，朱軍莉*

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018）

牛肉是中國僅次于豬肉的第二大消耗肉品，具有較好的行業(yè)前景。冷鮮肉能良好地保持肉品風(fēng)味和營養(yǎng)價值，逐漸成為肉類消費(fèi)的主流。冷鮮牛肉品質(zhì)與其微生物種類及數(shù)量密切相關(guān)，在冷鏈貯運(yùn)中由于嗜冷微生物繁殖代謝不斷積累醛、酮、胺、有機(jī)酸等物質(zhì)[1]，導(dǎo)致牛肉腐敗變質(zhì)。牛肉微生物菌群在貯藏過程的增長，導(dǎo)致牛肉品質(zhì)下降，與牛肉的貨架期密切相關(guān)[2]。在肉品復(fù)雜的微生物菌群中，只有一種或幾種特定腐敗菌在腐敗進(jìn)程中起著主導(dǎo)作用。

生鮮食品貯藏過程中菌群落鑒定主要依賴培養(yǎng)，它是實(shí)驗(yàn)室鑒定微生物最常用的方法，能簡便地計算出樣品中活菌的數(shù)量，并且是檢測某些特定腐敗菌的標(biāo)準(zhǔn)方法[3]。然而，培養(yǎng)方法可能很難檢測出數(shù)量較少的特定微生物種屬[4]，并且由于培養(yǎng)基成分不能滿足所有微生物的營養(yǎng)要求，及化學(xué)物質(zhì)敏感度或者選擇性不理想，會導(dǎo)致錯估微生物的菌群落結(jié)構(gòu)[5]。隨著分子生物學(xué)分析技術(shù)快速發(fā)展，高通量測序技術(shù)具有較好定量、節(jié)約時間、較精準(zhǔn)地檢測大多數(shù)菌種等優(yōu)點(diǎn)，逐步應(yīng)用于食品微生物菌群結(jié)構(gòu)分析[6]。采用高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)真空包裝豬肉中微球菌、腸桿菌、乳酸菌和肉桿菌是主要腐敗菌[7]。而高通量測序也存在一定問題，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增可能導(dǎo)致錯誤的相對豐度及產(chǎn)生嵌合序列[8]。因此，在食品復(fù)雜體系中的微生物菌群研究中需將培養(yǎng)依賴和培養(yǎng)非依賴的技術(shù)相結(jié)合。

目前冷鮮肉類的研究主要集中在貯藏品質(zhì)變化、腐敗菌分離鑒定和新保鮮技術(shù)研發(fā)[9-10]，而冷鏈中牛肉微生物菌群結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢菌致腐能力的系統(tǒng)研究仍較少。鑒于此，本研究以牛肉為研究對象，采用依賴培養(yǎng)的16S rDNA測序結(jié)合非培養(yǎng)的高通量測序分析牛肉在0 ℃貯藏的微生物菌群變化，鑒定冷鮮牛肉中的優(yōu)勢腐敗菌，評價其致腐性。研究為較全面了解冷鮮牛肉中微生物動態(tài)變化，分析主要特定腐敗菌，以期為靶向抑制腐敗菌生長，為高品質(zhì)牛肉冷鮮技術(shù)的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉由高沙農(nóng)貿(mào)市場提供，黃牛屠宰后，4 ℃充分冷卻排酸72 h，中心溫度降至0～4 ℃后取腰大肌（里脊）部位，冰運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，在無菌環(huán)境中分割成50 g左右小塊，置于塑料托盤中，覆蓋聚乙烯膜于（0±1）℃貯藏。本實(shí)驗(yàn)微生物分析牛肉樣品均為同一批次產(chǎn)品，且牛肉汁制作所用牛肉也為同一批次產(chǎn)品。

平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、熱死環(huán)絲菌STAA分離培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bile agar，VRBA）和乳酸菌MRS（De Man, Rogosa and Sharpe）分離培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽肉湯肉湯（brilliant green lactose bile broth，BGLB） 青島海博生物技術(shù)有限公司；高通量測序細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒 美國Omega公司；Quant-iT PicoGreen dsDNA分析試劑盒美國Thermo Fisher Scientific公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 日本BioFlux公司；PCR全套試劑 日本TaKaRa公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；NaCl、干酪素、Na2CO3、H3BO3、甲基紅、溴甲酚綠（均為分析純）、HCl（0.1 mol/L） 上海阿拉丁公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-75VE型高壓滅菌鍋、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱上海博訊公司；DYY-2c型電泳儀 北京六一儀器廠；QuantiFluor熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司；3-18K型離心機(jī) 德國Sigma公司；UV-1800型紫外分光光度計 日本Shimadzu公司；FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；

KDN-103F型凱氏定氮儀 上海華燁公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉感官評分

參考鄭加旭等[11]的感官評分方法，以可接受度作為感官評價標(biāo)準(zhǔn)，牛肉在0 ℃冷藏，每3 d定期取樣品，由6 名經(jīng)過訓(xùn)練的評價員評估其感官評分。0～3 分為好；3～6 分為中；6～9 分為差。

1.3.2 牛肉細(xì)菌總數(shù)測定

牛肉樣品在0 ℃冷藏，每3 d定期取樣，參考GB 4789.2—2016《菌落總數(shù)測定》[12]測定菌落總數(shù)，假單胞菌數(shù)、熱死環(huán)絲菌數(shù)、乳酸菌數(shù)與菌落總數(shù)測定方法相似，分別用CFC瓊脂、STAA瓊脂、MRS瓊脂和PCA計數(shù)，其中PCA和CFC瓊脂于30 ℃培養(yǎng)48 h，STAA瓊脂于22 ℃培養(yǎng)48 h。腸桿菌數(shù)參考GB 4789.3—2016《大腸菌群計數(shù)》[13]測定，用VRBA瓊脂計數(shù)。

1.3.3 細(xì)菌分離和16S rDNA鑒定

將冷鮮牛肉在貯藏初期0 d和末期2 1 d樣品培養(yǎng)后，挑取P C A上外觀形態(tài)不同的菌落1 3 株和1 5 株，純化后，挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，并提取基因組D N A，用通用引物[14]1 6 S F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和16S R（5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）擴(kuò)增16S rDNA片段，測序及拼接序列后，在NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST程序進(jìn)行核酸序列的同源性比對。

1.3.4 高通量測序

取采集的牛肉樣品各5 g，加入45 mL無菌生理鹽水，4 ℃條件下?lián)u床中振蕩2 h，4 ℃、200×g離心2 min，取上清液12 000×g再次離心2 min，棄上清液，收集沉淀。

DNA提?。簯?yīng)用OMEGA公司的DNA提取試劑盒提取上述沉淀中的細(xì)菌基因組DNA，用紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度。

PCR擴(kuò)增及高通量測序：采用通用引物[15]515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA。反應(yīng)條件均為98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。對純化后的PCR產(chǎn)物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA試劑盒在QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對基因文庫進(jìn)行定量；使用MiSeq測序儀進(jìn)行雙端測序。

數(shù)據(jù)分析處理，將測序獲得的雙端數(shù)據(jù)拼接成長的tag，并將序列上建庫引入的barcode和引物序列去除。此外，按照熒光信號強(qiáng)度修剪質(zhì)量值低的序列。利用Vsearch（https://github.com/torognes/vsearch）對序列進(jìn)行聚類，通過操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的Alpha多樣性分析得到樣品中OTU數(shù)目（豐富度）和群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性（均勻度）[16]。通過OTU稀釋曲線分析，評估測序量是否達(dá)標(biāo)。并與RDP數(shù)據(jù)庫和NT-16S數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對，選取豐度大于0.5%的物種分類，將其余的物種設(shè)置為others，以BIOM格式OTU表統(tǒng)計OTU豐度[17]。

1.3.5 無菌牛肉汁的制備和接種

無菌牛肉汁提取參考劉永吉[18]的方法，略作修改。具體如下：將100 g新鮮牛肉切碎后，用200 mL無菌水拍打成勻漿液，4 ℃、5 000×g離心15 min，將上清液過0.22 μm無菌濾膜后備用。將貯藏末期的15 株分離株過夜培養(yǎng)物，用生理鹽水稀釋至106～107CFU/mL，以1%接種到無菌牛肉汁，使初始濃度保持在104～105CFU/mL。牛肉汁在0 ℃冷藏，在第6、15天取樣進(jìn)行感官、pH值和揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值檢測，以接種無菌水的樣品作空白對照。

1.3.6 牛肉汁中感官和蛋白酶測定

取牛肉汁樣品5 mL，感官評價參考1.3.1節(jié)方法。并取牛肉汁1.5 mL在4 ℃、10 000×g離心10 min，上清液0.22 μm無菌濾膜后，參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[19]中的福林-酚方法測定蛋白酶活力。

1.3.7 牛肉汁中pH值和TVB-N值測定

牛肉汁混勻，離心，上清液0.22 μm無菌濾膜后，參照pH計說明書和GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[20]半微量定氮法測定pH值和TVB-N值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

牛肉冷藏中微生物鑒定實(shí)驗(yàn)和牛肉汁評價腐敗分離株致腐性均設(shè)計3 個重復(fù)，采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0軟件（OriginLab公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，并利用SPSS 19.0軟件（IBM公司）的AVOVA進(jìn)行方差分析，P＜0.05，差異顯著，結(jié)果為。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮牛肉感官評分腐敗菌總數(shù)變化

如圖1所示，牛肉在冷藏前9 d感官品質(zhì)保持較好，第12天肉品新鮮度下降，第15天出現(xiàn)異味，第18天樣品有酸敗味，感官品質(zhì)不可接受。冷鮮牛肉初始（0 d）菌落總數(shù)為4.06（lg（CFU/g）），表明樣品品質(zhì)良好。牛肉在0 ℃貯藏初期微生物緩慢增加，第3天增長快速，至第9天超過6（lg（CFU/g）），而第15天達(dá)到8.73（lg（CFU/g）），之后達(dá)到穩(wěn)定。牛肉在冷藏中CFC瓊脂上假單胞菌數(shù)、STAA瓊脂上熱死環(huán)絲菌數(shù)、VRBA瓊脂上腸桿菌數(shù)和MRS瓊脂上乳酸菌數(shù)不斷上升，其增長趨勢與菌落總數(shù)相似，其中假單胞菌數(shù)和熱死環(huán)絲菌數(shù)增長最快，腸桿菌數(shù)和乳酸菌數(shù)的增長較慢。牛肉貯藏末期假單胞菌數(shù)最高，熱死環(huán)絲菌次之，而腸桿菌數(shù)和乳酸菌數(shù)低于假單胞菌約2（lg（CFU/g））（P＜0.05）。結(jié)合感官評價和菌落總數(shù)，0 ℃冷藏牛肉的貨架期約為15 d。

圖1 牛肉0 ℃貯藏時感官評分和菌落數(shù)的變化Fig. 1 Changes in sensory score and microbial load of beef stored at 0 ℃

2.2 冷鮮牛肉菌相的16S rDNA鑒定

圖2 冷鮮牛肉新鮮肉和腐敗肉中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異Fig. 2 Bacterial community structures of all samples at the genus level

從新鮮牛肉和腐敗牛肉樣品分別挑選具有特異性形態(tài)的菌落13 株和15 株，經(jīng)純化及初步鑒定后發(fā)現(xiàn)新鮮肉和腐敗肉分別有9 株和11 株為革蘭氏陰性菌，表明牛肉中腐敗微生物菌群主要以革蘭氏陰性菌為主。將28 株菌以16S rDNA 通用引物PCR擴(kuò)增，測序后得到的序列采用GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST進(jìn)行同源性比對顯示，新鮮肉分離株中有4 株與熱死環(huán)絲菌有較高的同源性，約占30.77%；3 株與氣單胞菌屬（Aeromonasspp.）有較高的同源性，占23.08%，有2 株與不動桿菌屬（Acinetobacterspp.）有較高的同源性，約占15.38%，還有4 株分別與假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）、克雷伯氏菌屬（Klebsiellaspp.）和摩根氏菌屬（Morganellaspp.）同源性較高，各占7.69%（圖2）。而腐敗肉有10 株與假單胞菌有較高的同源性，約占66.67%，4 株與熱死環(huán)絲菌同源性較高，約占26.67%，還有1 株與蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）同源性較高，占6.67%。培養(yǎng)及生理生化特征結(jié)果顯示好氧革蘭陰性菌假單胞菌和陽性菌熱死環(huán)絲菌是冷鮮牛肉有氧貯藏下的優(yōu)勢腐敗菌[21]，Pennacchia等[22]對冷鮮牛肉可培養(yǎng)微生物群的高通量測序，發(fā)現(xiàn)貯藏20 d后假單胞菌等為優(yōu)勢腐敗菌，還有某些嗜冷腸桿菌，如格氏沙雷氏菌（Serratia grimesii）等。

2.3 冷鮮牛肉微生物高通量檢測分析

采用高通量測序技術(shù)進(jìn)一步分析冷鮮牛肉初始和腐敗樣品菌群分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)104 個屬的細(xì)菌和部分未分類的細(xì)菌被挖掘，其中新鮮牛肉中有89 種，腐敗牛肉中有43 種，其中兩個樣品中共有OTU數(shù)為27。選取其中相對豐度大于0.5%的7 個物種分類，繪制樣品豐度堆疊柱狀圖。如圖2所示，冷鮮牛肉貯藏前期的優(yōu)勢菌為嗜冷桿菌屬（Psychrobacterspp.，34.78%）、假單胞菌屬（22.64%）、乳桿菌屬（Lactobacillusspp.，12.21%）、棒狀桿菌屬（Corynebacteriumspp.，8.44%）、不動桿菌屬（7.76%）。而貨架末期的優(yōu)勢菌為假單胞菌屬（82.78%）、環(huán)絲菌屬（13.11%）、乳桿菌屬（1.90%）、嗜冷桿菌屬（1.27%）。Ercolini等[23]使用高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，牛肉低溫有氧和高氧貯藏下假單胞菌是主要腐敗菌。Ercolini等[24]運(yùn)用該技術(shù)分析顯示牛肉在低溫普通和氣調(diào)包裝初期微生物主要為假單胞菌和熱死環(huán)絲菌，而貯藏后期普通包裝假單胞菌優(yōu)勢生長，氣調(diào)包裝乳酸菌占優(yōu)勢。

上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)依賴16S rDNA結(jié)合不依賴培養(yǎng)高通量測序分析菌群種類基本相似，冷鮮牛肉初始菌相復(fù)雜，主要由熱死環(huán)絲菌、嗜冷菌、假單胞菌、不動桿菌、氣單胞菌等多種微生物構(gòu)成。隨著冷藏期的延長牛肉中腐敗菌相趨于簡單，其中假單胞菌和熱死環(huán)絲菌為優(yōu)勢腐敗菌，占主導(dǎo)地位。然而兩種方法在鑒定部分微生物種屬中仍存在一定偏差，特別是新鮮肉樣。通過培養(yǎng)依賴16S rDNA方法在新鮮牛肉未鑒定到嗜冷桿菌、乳桿菌、棒狀桿菌和溶桿菌，與PCA營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件的限制，導(dǎo)致這些菌不能生長有關(guān)。而培養(yǎng)依賴方法中發(fā)現(xiàn)的變形桿菌、克雷伯氏菌和摩根氏菌未能在高通量測序中找到，可能因其相對豐度過低，未被擴(kuò)增。

表1 腐敗肉假單胞菌分離株16S rDNA序列同源性分析Table 1 Homology analysis of 16S rDNA genes of Pseudomonas isolates

研究發(fā)現(xiàn)腐敗牛肉中假單胞菌是優(yōu)勢腐敗菌，如表1所示。同源性發(fā)現(xiàn)致腐菌假單胞菌中PS28、PS16、PS30、PS18、PS29、PS19六株與莓實(shí)假單胞菌（P. fragi）有較高同源性，PS26和PS20與嗜冷假單胞菌（P. psychrophila）有較高同源性，另外PS17與隆德假單胞菌（P. lundensis）、PS27與拉丁假單胞菌（P. lurida）有較高同源性。Casaburi等[25]相似地報道莓實(shí)假單胞菌是肉類中最常見假單胞菌，其次是隆德假單胞菌和熒光假單胞菌。Ercolini等[26]發(fā)現(xiàn)假單胞菌是有氧保藏冷鮮牛肉中的優(yōu)勢腐敗菌，所有莓實(shí)假單胞菌均能產(chǎn)生酯類揮發(fā)性物質(zhì)，對肉類腐敗起到重要作用?？梢?，莓實(shí)假單胞菌是冷鮮牛肉的優(yōu)勢腐敗菌。

2.4 優(yōu)勢腐敗菌在牛肉汁中致腐性評價

2.4.1 細(xì)菌生長

無菌牛肉汁可以提供牛肉中可作為能量和營養(yǎng)來源的物質(zhì)，為一種近似牛肉的營養(yǎng)介質(zhì)。細(xì)菌生長是細(xì)菌腐敗能力顯現(xiàn)的重要方面，在無菌牛肉汁中評價其生長特性，可以更客觀地模擬腐敗菌在牛肉中生長繁殖。牛肉汁空白組在貯藏期內(nèi)無細(xì)菌生長。如圖3所示，在貨架期前期（6 d），接種熱死環(huán)絲菌組、假單胞菌組和蜂房哈夫尼菌組分別達(dá)到7.23～7.33、6.80～7.10（lg（CFU/mL））和6.81（lg（CFU/mL））。在貨架期末期（15 d），接種牛肉汁的菌液濃度熱死環(huán)絲菌組達(dá)到8.43～8.50（lg（CFU/mL）），假單胞菌組為7.58～7.95（lg（CFU/mL）），而蜂房哈夫尼菌的菌液濃度達(dá)到8.46（lg（CFU/mL））。在3 種優(yōu)勢腐敗菌中熱死環(huán)絲菌和哈夫尼細(xì)菌菌液濃度較高，假單胞菌菌液濃度較低。

圖3 熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在0 ℃牛肉汁中的菌體生長Fig. 3 Growth rates of Brochothrix, Pseudomonas and Hafnia inoculated in sterilized beef juice stored at 0 ℃

2.4.2 感官評定

感官評定是評價肉制品品質(zhì)的重要指標(biāo)，因微生物生長繁殖過程中利用肉類蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，逐步積累代謝降解產(chǎn)物，導(dǎo)致牛肉汁出現(xiàn)渾濁、散發(fā)酸臭味和硫化氫味等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。如圖4所示，牛肉汁空白組感官評價良好。而接菌組感官品質(zhì)均呈下降趨勢，較空白組感官變化明顯。冷藏6 d接種熱死環(huán)絲菌組、假單胞菌組和蜂房哈夫尼菌組的感官評分分別達(dá)到1.33～2.17、2.67～6.33和4.00。15 d接種牛肉汁的感官評分熱死環(huán)絲菌組達(dá)到3.17～4.50；假單胞菌組為6.00～8.33，不可接受；而蜂房哈夫尼菌的感官評分達(dá)到8.33，也不可接受。在3 種優(yōu)勢腐敗菌中假單胞菌和哈夫尼細(xì)菌感官變化較快，其中莓實(shí)假單胞菌PS28最高，其次為PS30、PS26和PS27。假單胞菌和腸桿菌科細(xì)菌代謝利用氨基酸，釋放NH3等刺激性氣體，導(dǎo)致感官快速劣變[27]。而熱死環(huán)絲菌感官變化較小，可能與該菌在有氧條件下利用葡萄糖生成乙偶姻及乙酸，產(chǎn)生甜的氣味[28]有關(guān)。

圖4 熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在0 ℃牛肉汁中的感官評分Fig. 4 Sensory scores of sterilized beef juice inoculated with Brochothrix, Pseudomonas and Hafnia during storage at 0 ℃

2.4.3 蛋白酶活性

圖5 熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在0 ℃牛肉汁中的蛋白酶活性變化Fig. 5 Changes in protease activity of Brochothrix, Pseudomonas and Hafnia inoculated in sterilized beef juice during storage at 0 ℃

食品腐敗菌能夠分泌蛋白酶，分解動物性產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)，促進(jìn)微生物大量增殖，導(dǎo)致肉類腐敗。如圖5所示，熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和蜂房哈夫尼菌優(yōu)勢腐敗菌蛋白酶活性在第6天變化較小，僅發(fā)現(xiàn)假單胞菌PS26、PS20、PS16、PS27、PS28、PS29和PS30表現(xiàn)蛋白酶活性（P＜0.05），除PS30外在冷藏至第15天顯著增加（P＜0.05），分別達(dá)到32.13、5.66、3.00、10.77、10.62、1.40 U/mL，其中莓實(shí)假單胞菌PS26最高，其次為PS27和PS28。假單胞菌的蛋白酶活性具有菌株依賴[29]，而熱死環(huán)絲菌和蜂房哈夫尼菌未有蛋白酶活性。

2.4.4 pH值

圖6 熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在0 ℃牛肉汁中的pH值變化Fig. 6 Changes in pH value of sterilized beef juice inoculated with Brochothrix, Pseudomonas and Hafnia during storage at 0 ℃

如圖6所示，牛肉汁空白組初期pH值為6.10，冷藏15 d無變化（P＞0.05）。熱死環(huán)絲菌組冷藏6 d pH值下降至5.09～5.41（P＜0.05），假單胞菌組pH值上升至6.08～6.85（P＜0.05），蜂房哈夫尼菌組pH值達(dá)到6.23。貯藏至第15天，熱死環(huán)絲菌組中除BT7下降外其余無明顯降低（P＞0.05），假單胞菌組中PS16、PS17、PS19、PS26、PS27菌pH值顯著上升（P＜0.05），增至6.28～6.82，其余組無顯著變化（P＞0.05）；接種蜂房哈夫尼菌牛肉汁pH值為6.27。研究發(fā)現(xiàn)接種熱死環(huán)絲菌BT7和BT10的pH值最低，而接種假單胞菌PS28的pH值最高，達(dá)到7.18。冷藏牛肉汁的pH值變化與微生物代謝產(chǎn)物的積累有關(guān)，研究表明熱死環(huán)絲菌在有氧條件下以纈氨酸和亮氨酸為底物產(chǎn)生揮發(fā)性酸，導(dǎo)致牛肉汁pH值降低[28]，而假單胞菌和腸桿菌科細(xì)菌代謝利用蛋白質(zhì)，釋放氨等堿性物質(zhì)，導(dǎo)致肉類pH值上升[30]。

2.4.5 TVB-N值

圖7 熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在0 ℃牛肉汁中的TVB-N值變化Fig. 7 Changes in TVB-N value of sterilized beef juice inoculated with Brochothrix, Pseudomonas and Hafnia during storage at 0 ℃

牛肉冷藏期間TVB-N的累積是由于在微生物和酶的作用下，引起蛋白質(zhì)的脫氨、脫羧作用，降解產(chǎn)生氨及胺類等揮發(fā)性的堿性含氮物質(zhì)，是評價肉質(zhì)新鮮度最重要的指標(biāo)。從圖7可知，無菌牛肉汁初期TVB-N值為5.25 mg/100 mL。接種熱死環(huán)絲菌組、假單胞菌組和蜂房哈夫尼菌組在冷藏至第6天時，TVB-N值分別為6.30～7.00、5.60～10.85 mg/100 mL和7.00 mg/100 mL。冷藏15 d熱死環(huán)絲菌組中TVB-N值上升至8.23～8.58 mg/100 mL，假單胞菌組中除PS16和PS30外，其余接種牛肉汁TVB-N值上升至8.23～15.23 mg/100 mL（P＜0.05），其中莓實(shí)假單胞菌PS28菌株上升最快（P＜0.05）；而接種蜂房哈夫尼菌牛肉汁的TVB-N值達(dá)到8.23 mg/100 mL。

腐敗末期3 種優(yōu)勢腐敗菌均能在冷藏條件下緩慢生長，且表現(xiàn)不同的致腐性，假單胞菌和蜂房哈夫尼菌感官評分、pH值和TVB-N值高于熱死環(huán)絲菌，提示這兩種致腐菌能形成氨類代謝產(chǎn)物。并且假單胞菌表現(xiàn)較強(qiáng)的蛋白酶活性。從雞肉中分離出致腐性沙雷氏菌、假單胞菌和殺鮭氣單胞菌，也顯示假單胞菌組TVB-N值、pH值均高于其他分離菌，且異味和黏液分泌明顯[31]。而接種的熱死環(huán)絲菌對真空包裝牛肉感官影響較小[32]。Gribble等[33]對接種熱死環(huán)絲菌和腸桿菌的真空包裝羊肉的顏色、氣味以及產(chǎn)氣能力評價顯示腸桿菌致腐性更強(qiáng)，更早形成腐敗。在多株牛肉源的假單胞菌分離株中莓實(shí)假單胞菌PS28致腐性最強(qiáng)，相似地報道莓實(shí)假單胞菌形成酯、酮、醇、硫化合物等多種不良的風(fēng)味物質(zhì)[25]。

3 結(jié) 論

研究采用培養(yǎng)依賴16S rDNA鑒定結(jié)合高通量測序技術(shù)較詳實(shí)地分析冷鮮牛肉冷藏中微生物群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)冷鮮牛肉貯藏初期細(xì)菌表現(xiàn)多樣性，而腐敗終點(diǎn)菌群種類明顯下降，以假單胞菌和熱死環(huán)絲菌為優(yōu)勢腐敗菌。腐敗末期優(yōu)勢腐敗菌表現(xiàn)不同的致腐性，其中假單胞菌和蜂房哈夫尼菌致腐性強(qiáng)于熱死環(huán)絲菌，假單胞菌還表現(xiàn)較強(qiáng)的蛋白酶活性，其中莓實(shí)假單胞菌PS28致腐性最強(qiáng)?？梢?，冷鮮牛肉中的特定腐敗菌是莓實(shí)假單胞菌。