王淑娟，劉 程，方水琴，田亞晨，董慶利，王 翔，許東坡,*，劉 箐,2,*

（1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093；2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室，海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266071）

大腸桿菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）屬革蘭氏陰性桿菌，是最常見的食源性致病菌之一，在世界范圍內普遍存在，廣泛分布于土壤、水和食物中[1]。它是出血性結腸炎和溶血性尿毒癥綜合征的主要致因[2]。該菌引起的發(fā)病率高，低至100 個大腸桿菌O157:H7細胞可引起易感病人腸道內的病原體生長，產生志賀毒素[3]。因此對大腸桿菌O157:H7的高靈敏度、快速和選擇性檢測對預防疾病爆發(fā)，保障食品安全和人體健康具有重要意義。

目前，大腸桿菌O157:H7最常用的檢測方法包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法、酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[4]和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）[5]。傳統(tǒng)培養(yǎng)法包括預富集、選擇性富集、生化篩選和血清學確認，費時費力[6]。PCR等分子方法雖然靈敏度高，能實現快速檢測[7]，但通常需要DNA提取等樣品預處理步驟，且聚合酶易被某些樣品成分抑制，有樣品交叉污染的風險，限制了其在發(fā)展中國家的應用[8]。免疫學分析取決于抗原和抗體之間的特定相互作用，此類用于檢測大腸桿菌O157:H7的方法有電致化學發(fā)光傳感器[9]、電化學生物傳感器[10]、熒光生物傳感器[11]、化學傳感器[12]等，這些方法處理簡單、分析時間短、靈敏度高，在實際應用中具有良好的潛力。

常規(guī)ELISA中，通常采用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）催化底物產生檢測信號。該方法的靈敏度低且需預增菌等步驟，整個檢測過程長達7 h。HRP作為催化劑有很多的局限性，如熱穩(wěn)定性差、純化時間長、成本高、最佳pH值范圍窄，且對大多數有機溶劑和金屬離子的耐受性低等[13]。這些內在缺陷極大地阻礙了天然酶的實際應用。解決這一問題的方法是構建更穩(wěn)定、更容易獲取的仿生酶，包括貴金屬及其合金、環(huán)糊精、金屬有機骨架等。金屬有機骨架材料是利用各種金屬離子和有機連接體設計的一類先進的具有高孔隙率的晶體材料。因其具有熱穩(wěn)定性、離散結構有序、密度低、比表面積大（超過6 000 m2/g）、易于合成以及適用于物理和化學應用的廣譜特性，在氣體儲存或分離[14]、藥物運輸[15]、催化[16]等領域引起了廣泛關注。目前報道已經有20 000 個金屬有機骨架材料具有催化性能[17]，如MIL-68、MIL-100、Cu-MOF等。如Zhang Jianwei等[18]發(fā)現兩種Fe（III）基金屬有機骨架具有類似于過氧化物酶的作用，利用這一特性建立了一種簡單、高靈敏度的比色法檢測過氧化氫（H2O2）和抗壞血酸。Wang Shuqin等[19]合成了Cu-MOF材料經戊二醛活化后與金黃色葡萄球菌適配體結合，利用Cu-MOF的催化性能檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，檢測范圍為50～10 000 CFU/mL，檢測限為20 CFU/mL。

本實驗以大腸桿菌O157:H7為檢測對象，結合金屬有機骨架材料（ZIF-67）的催化性能，替代傳統(tǒng)的HRP對抗體進行標記，并通過磁性微球富集目標物，建立一種新型的基于雙抗體夾心法的牛奶中大腸桿菌O157:H7的快速定量檢測方法。該方法旨在嘗試將金屬有機骨架材料與食源性致病菌檢測相結合，建立食源性致病菌檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒙牛利樂包牛奶 市購。

大腸桿菌O157:H7（ATCC43895）、單核細胞增生李斯特菌（ATCC43251）、鼠傷寒沙門氏菌（CMCC（B）50115）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213）均為本實驗室保藏。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、大腸桿菌O 1 5 7:H 7顯色培養(yǎng)基 北京陸橋技術股份有限公司；CoCl2-6H2O、3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）、30% H2O2、氫氧化鈉（NaOH）、無水乙醇、濃硫酸、50%戊二醛 國藥集團化學試劑有限公司；氨基功能化磁性微球（Fe3O4-NH2，200 nm） 阿拉丁試劑公司；2-甲基咪唑阿達瑪斯試劑公司；HRP、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司；大腸桿菌O157:H7多克隆抗體和單克隆抗體（D3）由本實驗室自制，效價分別為1∶8 000和1∶64 000。

1.2 儀器與設備

ZD-600加熱攪拌器 上海實驗儀器廠有限公司；SpectraMaxM2酶標儀 美國Molecular Devices公司；Philips XL30掃描電鏡（scanning electronic microscopy，SEM） 荷蘭Netherlands公司；D4 X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 德國Bruker公司；Electron Nicolet 380傅里葉變換紅外光譜 美國Thermo公司；DHG-9203A烘箱 上海一恒科學儀器有限公司；5810R高速離心機 艾本德中國有限公司；7100恒溫水浴鍋日本日立公司；BSC-1600IIA2生物安全柜 蘇凈科學器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ZIF-67的合成

Bola型兩親性表面活性劑依據文獻[20]合成。ZIF-67的合成方法參照Pan Yong等[21]并加以改進，具體方法如下：稱取0.056 g Bola型兩親性表面活性劑溶于400 mL水中，80 ℃分散溶解，加入1.64 g 2-甲基咪唑，4.74 g CoCl2·6H2O，繼續(xù)攪拌反應4 h，反應產物經離心分離后乙醇和水洗滌3 遍，70 ℃烘箱干燥12 h。

1.3.2 ZIF-67的表征

XRD分析可獲得ZIF-67的晶體結構，該掃描條件為電壓40 kV、電流40 mA、掃描范圍10°～80°、步寬0.02°、掃描速率10°/s；以掃描電子顯微鏡研究ZIF-67的形貌、結構以及顆粒大小等，加速電壓20 kV，樣品室真空度小于2.7×10-5Pa。

1.3.3 ZIF-67類過氧化物酶性能分析

以H2O2為底物，TMB為供氫體，濃硫酸為反應終止液，檢測A450nm，比較0.5 mg/mL HRP與1 mg/mL ZIF-67的催化性能。

1.3.4 溫度、pH值、反應時間、TMB濃度對ZIF-67催化性能的影響

為研究ZIF-67納米粒子的催化作用，對溫度（4、25、37、40、50、60、70、80 ℃）、pH值（0.1 mol/L NaOH，蒸餾水，0.5、1、2 mol/L H2SO4）、反應時間（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 min）、TMB濃度（50、100、150、200、250、300、350、400、500 μmol/L）進行研究。進行單因素研究時，保證其他條件一致。稱取0.05 g ZIF-67溶解于100 mL蒸餾水中，超聲溶解，配制成0.5 mg/mL的ZIF-67溶液。于常溫下保存待用。反應后的溶液在離心管中混勻后轉移至96 孔酶標板中，每孔加200 μL，測定A450nm。每個處理2 個平行。

1.3.5 細菌的培養(yǎng)

將大腸桿菌O157:H7（ATCC 43895）、單核細胞增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌分別接種于20 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱內37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，取1 mL菌液，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用1 mL無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS，pH 7.4）重懸。用無菌PBS將重懸后的大腸桿菌O157:H7純菌液進行10 倍系列稀釋。

1.3.6 Fe3O4-NH2與大腸桿菌O157:H7多克隆抗體的結合

采用戊二醛活化法對材料進行活化，具體方法如下：稱取0.1 g氨基功能化磁性微球用0.01 mol/L的PBS沖洗3 遍后，分散于含20 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）的50 mL離心管中，加入50%戊二醛使其最終質量濃度為1.25 g/100 mL，37 ℃搖床活化2 h后，用磁鐵完全吸附后倒去上清液，沉淀用無菌水沖洗3 次，以去除殘留的戊二醛；隨后，加入10 mg大腸桿菌O157:H7多克隆抗體，混合物在4 ℃搖晃24 h后用磁鐵完全吸附Fe3O4-NH2-抗體復合物后倒掉上清液，以去除多余未結合的抗體。然后，用1% BSA重懸Fe3O4-NH2-抗體復合物后在4 ℃封閉2 h，以避免非特異性吸附。最后，通過磁鐵吸附、無菌水沖洗等步驟后，重懸于10 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）中，放置4 ℃保存。

1.3.7 ZIF-67與大腸桿菌O157:H7單克隆抗體D3結合

同樣采用戊二醛活化法，稱取0.06 g ZIF-67用0.01 mol/L的PBS沖洗3 遍，經8 000 r/min離心5 min后，分散于含20 mL 0.01 mol/L PBS（pH7.4）的50 mL離心管中，加入50%戊二醛使其終質量濃度為1.25 g/100 mL，37 ℃搖床活化2 h?；罨蟮腪IF-67經8 000 r/min離心5 min棄掉上清液，沉淀用無菌水沖洗3 次，以去除殘留的戊二醛；隨后，加入4 mg大腸桿菌O157:H7單克隆抗體（D3），混合物在4 ℃攪拌24 h，反應產物在4 000 r/min離心10 min以去除多余的抗體。然后，用1% BSA 4 ℃封閉2 h，以避免非特異性吸附。最后，通過離心、水沖洗后，重懸于10 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）中，放置4 ℃保存。

1.3.8 細菌培養(yǎng)及計數

將凍存在-80 ℃的甘油菌經2 次活化后，按1∶100的比例轉接到20 mL新鮮的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。

計數方法：在生物安全柜中，從上述菌液中吸取100 μL加到含900 μL的無菌PBS的離心管中，振蕩數秒計為10-1倍稀釋，按照此方式，依次進行10 倍稀釋分別計為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6混勻后分別吸取100 μL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，每個稀釋度作3 次平行。倒置后于37 ℃培養(yǎng)48 h。按照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》方法進行菌落計數。

1.3.9 新型基于ZIF-67的雙抗體夾心法在食品中大腸桿菌O157:H7的實際檢測

在1.5 mL離心管中依次加入100 μL Fe3O4-NH2-多抗、100 μL ZIF-67-D3和50 μL大腸桿菌O157:H7（101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL），混勻后在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。反應結束后用磁鐵吸附2 min后棄去上清液，并用0.01 mol/L無菌PBS進行清洗3 次并棄掉上清液；然后分別依次在離心管中加入100 μL 0.5 mmol/L TMB和100 μL 1 mol/L H2SO4；混勻并用磁鐵吸附2 min后吸取200 μL上清液至96 孔酶標板中，置于SpectraMax M2酶標儀中讀取A450nm；以A450nm為縱坐標，大腸桿菌O157:H7濃度為橫坐標，建立標準曲線，以0.01 mol/L PBS為空白對照得到A0，濃度梯度的大腸桿菌O157:H7得到A，最后結果以A-A0計算得到線性方程，并計算R2值。

1.3.10 方法的特異性及實際應用研究

將凍存在-80 ℃的甘油菌（大腸桿菌O157:H7（ATCC 43895）、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌）經2 次活化后，按1∶100的比例轉接到20 mL新鮮的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。經平板計數后分別將5 種菌懸液稀釋至106CFU/mL。100 μL Fe3O4-NH2-多抗、100 μL ZIF-67-D3和50 μL上述菌懸液（106CFU/mL），以無菌PBS作陰性對照，按照1.3.9節(jié)中的方法進行顯色和計算。最后結果以A-A0計算作圖，驗證其特異性。

1.3.11 人工污染牛奶樣品的檢測

將大腸桿菌O157:H7人工接種到牛奶中，制備成人工污染的牛奶樣品，濃度為3.3×102～3.3×105CFU/mL。按照上述方法進行吸光度的檢測，以無菌牛奶做陰性對照，每個濃度分別用該方法和大腸桿菌O157:H7顯色平板計數法做3 次重復。

1.4 數據處理

ZIF-67 XRD結果和傅里葉紅外光譜結果導出txt文檔后采用Graph Pad軟件進行繪制。其余結果均通過Graph Pad軟件繪制完成。

2 結果與分析

2.1 ZIF-67的合成與結果

圖1 ZIF-67的SEM圖譜（a）和XRD圖譜（b）Fig. 1 SEM (a) and XRD (b) profile of ZIF-67

合成的ZIF-67為綠色粉末，SEM圖譜（圖1a）ZIF-67為規(guī)則的納米薄片，尺寸約500 nm，XRD（圖1b）結果表明ZIF-67的結晶度較好，和文獻[21]中合成的ZIF-67出峰位置一致，說明ZIF-67合成成功。

2.2 ZIF-67與HRP催化性能的比較

如圖2所示，H2O2存在時，ZIF-67和HRP都可以催化TMB顯色，說明ZIF-67具有過氧化物酶樣催化性能。而在H2O2不存在時，HRP不能催化TMB顯色，而ZIF-67依然可以催化TMB顯色，對此現象的解釋為金屬有機骨架材料能夠提供具有活性金屬中心的非常高的表面積，確保了在活性金屬中心的情況下，氧氣容易進入，從而發(fā)揮其催化作用[19,22]。

2.3 溫度、pH值、反應時間、TMB濃度對ZIF-67催化性能的影響

ZIF-67催化TMB顯色不需要H2O2即可完成，所以不再討論H2O2濃度對其催化性能的影響。如圖3所示，ZIF-67催化反應最佳條件為室溫、200 μmol/L TMB、0.5 mol/L硫酸終止液，且該催化作用不受時間的限制?；谝陨献罴逊磻獥l件，以ZIF-67濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，結果表明ZIF-67自身線性良好，R2為0.994 7。

圖3 反應條件對ZIF-67催化性能的影響Fig. 3 Effect of reaction conditions on catalytic performance of ZIF-67

2.4 定量檢測大腸桿菌O157:H7方法的建立

由于氨基功能化磁性微球本身在無H2O2時不可催化TMB顯色，所以本實驗通過沉淀顯色法：即通過氨基功能化磁性微球特異性富集大腸桿菌O157:H7后，檢測與其結合的ZIF-67的量，從2.3節(jié)可知，ZIF-67本身線性良好，說明可以通過ZIF-67的量間接檢測大腸桿菌O157:H7的量。通過上述方法，以大腸桿菌O157:H7濃度為橫坐標，A-A0為縱坐標，建立大腸桿菌O157:H7濃度梯度標準曲線。大腸桿菌O157:H7的檢測線性濃度范圍為17～1.7×108CFU/mL（平板計數結果）。檢測限通過計算3σ[23]（σ為空白樣品測量的標準偏差）為17 CFU/mL。R2為0.990 6，說明該方法可以用于大腸桿菌O157:H7的定量檢測，且線性結果良好。

2.5 人工污染牛奶中大腸桿菌O157:H7檢測及方法的特異性

對人工污染大腸桿菌O157:H7的牛奶樣品，選取4 個稀釋度（3.3×102～3.3×105），按照上述方法進行檢測，與大腸桿菌O157:H7顯色平板上的檢測結果進行對比，表1表明，該方法的檢測結果與平板計數結果一致，相對標準偏差為6.73%～11.4%，回收率為100%～105%。而且與常見的食源性致病菌（鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌）進行對比（圖4），該方法的特異性強。

表1 人工污染牛奶樣品中大腸桿菌O157:H7的檢測Table 1 Detection of E. coli O157:H7 in real milk samples

圖4 特異性分析Fig. 4 Analysis of specificity

2.6 與其他檢測大腸桿菌O157:H7方法的比較

與其他方法相比（表2），本實驗中的新型基于ZIF-67催化顯色的免疫學方法檢測大腸桿菌O157:H7的檢測范圍寬，檢測限和PCR及其他高靈敏度傳感器檢測方法一致，且不需任何昂貴的儀器設備，操作簡單、檢測時間短、無需樣品前增菌和預富集。

表2 與其他檢測大腸桿菌O157:H7方法的比較Table 2 Comparison of this method with other methods for detection of E. coli O157:H7

3 結 論

本研究建立了一種基于金屬有機骨架材料（ZIF-67）催化性能的快速檢測牛奶中大腸桿菌O157:H7的方法。該方法的檢測范圍為17～1.7×108CFU/mL，檢測限為17 CFU/mL。該方法是通過檢測與大腸桿菌O157:H7結合的ZIF-67的量間接確定細菌數量的定量檢測，檢測過程可在1 h內完成。和其他檢測方法相比，無需昂貴儀器及對樣品的前處理。因此，該方法是一種特異性高、快速、靈敏度高的雙抗體夾心免疫學檢測方法，為大腸桿菌O157:H7的快速檢測開辟了新途徑，在食品檢測領域具有很好的發(fā)展前景。