東方伊薩酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵楊梅酒的發(fā)酵效率及風(fēng)味特征分析

張文文，翁佩芳*，吳祖芳

（寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315800）

楊梅（Myrica rubraSieb. et Zucc.）是我國傳統(tǒng)特產(chǎn)水果，楊梅顏色鮮艷，酸甜適口，具有較高的營養(yǎng)價值和重要的藥用價值[1]。但是由于楊梅沒有果皮保護，又成熟于高溫多雨的5—7月，使得楊梅易腐爛而難保藏，在4 ℃條件下只能存放9～12 d[2]，往往不能及時銷售和加工而造成大量浪費。隨著果酒成為國家重點發(fā)展的酒類及人們對健康生活方式的追求，以水果為原料釀造具有一定保健功效的各類果酒需求量逐年增加[3]。利用楊梅原料釀造的楊梅酒，香醇爽口，具有高營養(yǎng)、低乙醇體積分?jǐn)?shù)的特點，不僅提高楊梅附加值，而且滿足各類消費群體對高質(zhì)量生活的追求[4]。

酵母菌是果酒生產(chǎn)的一個關(guān)鍵要素，直接影響到楊梅酒的風(fēng)味質(zhì)量[5]。目前，國內(nèi)楊梅果酒釀造所用酵母菌幾乎都是商業(yè)化酵母，應(yīng)用于楊梅酒發(fā)酵會造成酒體風(fēng)味不足，不能滿足消費者的需求[6]。非釀酒酵母從變質(zhì)的酒體中分離出來，曾一度被認(rèn)為是果酒發(fā)酵過程中的腐敗酵母菌，但隨著果酒釀造研究的深入，非釀酒酵母對果酒品質(zhì)的作用得到了肯定[7-8]。它們可以合成多種酶，將原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酯、酸、高級醇等風(fēng)味物質(zhì)，并對果酒的色澤產(chǎn)生重要影響，但也存在一些缺陷，比如耐乙醇能力弱（尤其在SO2存在條件下）、發(fā)酵力低以及乙酸產(chǎn)量高等。因此，采用釀酒酵母與非釀酒酵母進行混合發(fā)酵是當(dāng)前的研究熱點之一。鐘瑞敏等[9]發(fā)現(xiàn)葡萄酒釀酒活性干酵母作為主發(fā)酵菌種，成品酒酒色偏淡，且酒香單薄，但若配合0.1%生香酵母或釀酒高活性酵母可在一定程度上改善楊梅酒酒質(zhì)。賈言言等[10]研究發(fā)現(xiàn)，梅奇酵母（Metschnikowia agaves）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）順序接種發(fā)酵時，能更好地保留原果香，并增加香氣成分的種類及乙酸酯類含量。類星形假絲酵母菌（Candida stella）和畢赤發(fā)酵酵母（Pichia fermentans）與Sc混合發(fā)酵可以增加巴貝拉紅葡萄酒中酯類、脂肪酸和降異戊二烯化合物濃度[11]。耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans）可以提高發(fā)酵液總酸度并增加苯乙醇、甘油的含量；梅奇酵母（M.agaves）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis，Io）和有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）能積累更多的高級醇[12]。粟酒裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces pombe）則可降解蘋果酸并產(chǎn)生較多的甘油、酯類和乙酸[13]。釀酒酵母與非釀酒酵母共發(fā)酵是調(diào)節(jié)果酒揮發(fā)性成分、提高果酒香氣復(fù)雜性的重要途徑。

關(guān)于混菌發(fā)酵楊梅酒，國內(nèi)研究集中在工藝優(yōu)化方面，對其內(nèi)在機理的探究鮮見報道，由于楊梅酒的地域特色，國外學(xué)者對楊梅酒也少有研究。鑒于商業(yè)化釀酒酵母能夠耐受較高濃度乙醇，具有較強的有限營養(yǎng)物質(zhì)競爭能力，保障果酒風(fēng)味[14]，又由于楊梅中尖酸味的蘋果酸含量多[15]，以楊梅為原料釀制而成的楊梅酒含酸量也較高，而Io能夠降低果酒中的蘋果酸[16-17]。本研究將目前使用的商業(yè)化Sc（安琪葡萄酒活性干酵母）和實驗室自主分離篩選獲得的產(chǎn)風(fēng)味較好的非釀酒酵母（Io166）混合發(fā)酵，分析對發(fā)酵周期的影響，并探討相關(guān)代謝物對楊梅酒感官特性（風(fēng)味）的影響，以期為高品質(zhì)楊梅酒的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊梅：荸薺種楊梅，采于浙江省寧波市余姚，采摘后1 h內(nèi)運到實驗室，采用榨汁機獲得楊梅汁，并經(jīng)4 層無菌紗布過濾，使用前-80 ℃冷凍保存。使用時在常溫下自然解凍。

菌種：Io166為寧波大學(xué)食品生物技術(shù)實驗室保存；安琪葡萄酒活性干酵母（菌種鑒定為酵母屬Sc菌株），購自安琪酵母股份有限公司。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、碳酸鈉、殼聚糖（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑上海有限公司；酒石酸鉀、碳酸鉀（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蔗糖（食品級） 市購；偏重亞硫酸鉀（食品級） 煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-7000C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國Agilent公司；DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm） 美國Supelco公司；SpectraMax 190酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅酒釀造工藝流程

楊梅原汁制備→過濾→成分調(diào)整（碳酸鈉調(diào)pH 3.5，蔗糖調(diào)糖度22°Brix）→巴氏滅菌（75 ℃，15 min）→添加SO2（100 mg/L偏重亞硫酸鉀）→加酵母控溫發(fā)酵（27 ℃）→虹吸分離→后發(fā)酵1 個月（18 ℃）→澄清（80 mg/L的殼聚糖）→降酸（2 g/L酒石酸鉀+1 g/L碳酸鉀）→冷凍1 周（4 ℃）→過濾（0.22 μm濾膜）→灌裝→楊梅酒

楊梅酒的混菌發(fā)酵是將Io與Sc分別以6×106、6×105CFU/mL同時接入處理過的楊梅汁中，進行混合發(fā)酵，以Io和Sc單菌發(fā)酵楊梅汁作為對照，Io和Sc純種發(fā)酵液中的初始接種濃度分別為6×106CFU/mL和6×105CFU/mL。

1.3.2 酵母生長、總糖、還原糖和乙醇體積分?jǐn)?shù)的測定

酵母生長測定：采用YPD平板計數(shù)法，其中混合發(fā)酵中，依據(jù)兩種酵母菌在YPD固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)不同計數(shù)?？偺羌斑€原糖含量測定：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[18]；乙醇體積分?jǐn)?shù)：采用愛爾蘭Megazyme公司乙醇測定試劑盒測定。發(fā)酵效率以總糖降至5 g/L時所需發(fā)酵時間作為考察指標(biāo)。

1.3.3 GC-MS分析

1.3.3.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)頂空固相微萃?。╤ead space solid phase microextraction，HS-SPME）

吸取5 mL楊梅酒于頂空瓶中，再加入1.4 g氯化鈉，和無水乙醇稀釋過的10 mg/L仲辛醇20 μL作為內(nèi)標(biāo)，于60 ℃平衡15 min。將老化后的固相微萃取頭插入平衡后的樣品頂空恒溫振蕩萃取30 min，振蕩速率為250 r/min。取出插入氣相色譜柱的進樣口解吸附7 min，解吸溫度為210 ℃。

1.3.3.2 GC-MS條件

色譜條件：毛細管柱為Vocal（60 m×0.32 mm，1.8 μm）。載氣為高純氦氣，恒定流速3 mL/min，進樣口溫度210 ℃，不分流進樣模式。柱溫箱采用程序升溫，起始溫度35 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升到40 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升到200 ℃，保持20 min。

質(zhì)譜條件：采用全掃描模式采集信號，電離方式為電子電離，電子轟擊能量為70 eV；接口溫度220 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描質(zhì)量范圍m/z 40～600，掃描頻率3.6 scans/s。

1.3.3.3 定性定量分析

化合物經(jīng)計算機檢索與NIST 14 Library相匹配。選擇較高匹配度的檢索結(jié)果，并結(jié)合文獻報道的已知化合物確認(rèn)檢測物成分，各化合物含量根據(jù)內(nèi)標(biāo)2-辛醇進行定量。

1.3.4 感官分析

采用定量描述分析方法，由6 位經(jīng)驗豐富的感官品評員（3 名女性和3 名男性）對楊梅酒進行評價，獲得評價選用的主要感官描述詞。品評員被要求在每一個描述詞上對楊梅酒樣本按照5 點標(biāo)度法進行打分。0～5 分別表示沒感覺、弱、稍弱、平均、稍強和強。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Origin 9.1（Northampton，MA，USA）作圖，SPSS 24.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan法差異分析，P＜0.05，差異顯著；對3 種楊梅發(fā)酵酒香氣成分的含量進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵體系中酵母菌的生長變化情況

在釀酒過程中，非釀酒酵母種類廣泛且具多樣性，其濃度在101～106CFU/mL之間[19]，結(jié)合前期對Io和Sc生長曲線測定結(jié)果，及避免Sc旺盛繁殖對Io的抑制作用，從而影響楊梅酒成品的香氣成分，故混菌發(fā)酵液中Io和Sc初始濃度分別選擇了6×106CFU/mL和6×105CFU/mL。

圖1 不同菌種發(fā)酵體系中酵母菌生長動態(tài)變化Fig. 1 Dynamic changes in yeast growth in different fermentation systems

從圖1可以看出，在純種發(fā)酵中，Sc的生長速率較Io快，雖然Sc的起始接菌量不高，但在24 h細胞濃度有近108CFU/mL。同樣，Io純種發(fā)酵中，Io在前24 h快速增殖，之后Io生長勢頭減弱，穩(wěn)定增長至發(fā)酵第9天達到峰值，之后開始衰亡，此時發(fā)酵液的乙醇體積分?jǐn)?shù)為5.48%。而Sc純種發(fā)酵至第6天后開始衰亡，此時發(fā)酵液的乙醇體積分?jǐn)?shù)為9.95%。說明Io和Sc分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%和10%時生長受到抑制。

在混菌發(fā)酵體系中，Io和Sc表現(xiàn)出相似的生長規(guī)律，都在發(fā)酵第2天細胞濃度達到最大值，此時發(fā)酵液的乙醇體積分?jǐn)?shù)為4.54%，此后Io迅速衰亡，至發(fā)酵第9天幾乎不能檢測到，這與Io純種發(fā)酵結(jié)果具有一致性，說明Io對乙醇較為敏感，易受到乙醇的脅迫作用。Miao Yingjie等[20]的研究顯示，乙醇脅迫會導(dǎo)致分子伴侶HSP 90和HSP 70以及泛素-蛋白酶體途徑相關(guān)的基因上調(diào)，致使蛋白錯誤折疊并形成聚集體毒害細胞?；炀w系中，Sc與Io呈現(xiàn)相似的生長規(guī)律，即發(fā)酵2 d后細胞開始衰亡，由此推測，兩者細胞濃度的下降可能與混合發(fā)酵體系中營養(yǎng)物質(zhì)的競爭和細胞的群體感應(yīng)等因素有關(guān)。研究表明，Io在乙醇脅迫下許多參與養(yǎng)分吸收的基因上調(diào)[20]。劉茜等[21]發(fā)現(xiàn)Io代謝精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸的速率較Sc快。Renault等[22]研究了混合發(fā)酵體系中戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）和Sc的生長變化，發(fā)現(xiàn)酵母細胞間的接觸抑制造成了T. delbrueckii的早期死亡。

2.2 不同發(fā)酵體系中pH值、總糖和還原糖的變化分析

圖2 不同菌種發(fā)酵體系中pH值（A）、總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）的變化Fig. 2 Changes in pH (A), total sugar content (B) and reducing sugar content (C) in different fermentation systems

從圖2A可以看出，不同菌種及其混合發(fā)酵方式下發(fā)酵液的pH值呈現(xiàn)相同的變化趨勢，當(dāng)pH值下降到一定程度后又會緩慢上升，發(fā)酵前期，酵母菌利用發(fā)酵液中糖類進行生長繁殖，產(chǎn)生一些酸類物質(zhì)，故使發(fā)酵液中的pH值降低。這個結(jié)果與發(fā)酵第1天Sc在純種發(fā)酵體系和混菌發(fā)酵體系中迅速增殖的現(xiàn)象相吻合。發(fā)酵后期，酵母菌處于旺盛的乙醇發(fā)酵階段，部分酸類物質(zhì)與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，故pH值升高[23]。而混菌發(fā)酵和Sc發(fā)酵pH值變化基本同步，在主發(fā)酵第2天pH值達到最低，分別為3.29和3.26，這與混菌發(fā)酵液中Sc大量增殖，發(fā)酵階段競爭能力較強有關(guān)。

糖是乙醇發(fā)酵的基質(zhì)，酵母菌將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)變成乙醇、CO2和其他一些副產(chǎn)物。從圖2B可以看出，Io發(fā)酵液總糖含量下降緩慢，說明Io作為非釀酒酵母，對糖的利用效率顯著低于Sc。前期實驗中，分別對Io和Sc進行不同碳源（蔗糖、葡萄糖和果糖）的純培養(yǎng)生長測定，發(fā)現(xiàn)Io在以葡萄糖和果糖為碳源時具有較好的生長量，而蔗糖利用性相對較差，可能由于葡萄糖和果糖作為可發(fā)酵性糖，可以直接進入糖酵解途徑被菌體利用，因而菌體生長較快；蔗糖被菌體利用時，首先需要在二糖水解酶的作用下水解形成單糖，因而菌體生長較慢。而Sc對這3 種碳源利用能力基本相同。從圖2C也可以看出，Io優(yōu)先利用還原糖進行楊梅酒發(fā)酵，而Sc將蔗糖水解成果糖和葡萄糖的同時，也能實現(xiàn)對糖的快速利用。故混菌發(fā)酵液中殘余總糖含量能被快速消耗，且第11天發(fā)酵液殘?zhí)橇烤托∮? g/L，比Sc發(fā)酵酒提早結(jié)束主發(fā)酵。

2.3 不同發(fā)酵體系中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比較

香氣是衡量果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，香氣的形成過程復(fù)雜，按照來源可以概括為品種香、發(fā)酵香和陳釀香，其中果酒中主要的香氣物質(zhì)是通過酵母菌的乙醇發(fā)酵作用下轉(zhuǎn)化而來，故酵母對果酒香氣的形成起著至關(guān)重要的作用[24]。采用HS-SPME-GC-MS對混菌發(fā)酵楊梅酒和純種發(fā)酵楊梅酒進行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定，結(jié)果如表1所示。

表1 混菌發(fā)酵和純種發(fā)酵楊梅酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量Table 1 Comparisons of volatile flavor compounds of Chinese bayberry wines from pure and mixed-culture fermentations

續(xù)表1

由表1可以看出，酵母菌純種發(fā)酵及混合發(fā)酵的楊梅酒中共鑒定出59 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，包括酯類30 種、醇類7 種、酸類6 種、烯萜類3 種、醛類2 種、酮類2 種、烴類及其他類9 種；其中含量較高的是辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇、反式石竹烯和2,3-環(huán)氧-4,4-二甲基戊烷。以下從酯類、醇醛酮類及酸類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)解析不同發(fā)酵體系對楊梅酒香氣形成的影響。

2.3.1 酯類物質(zhì)

酒風(fēng)味在很大程度上與酯類的組成及含量有關(guān)，酵母菌在乙醇發(fā)酵過程中通過酯酶或醇?；D(zhuǎn)移酶的作用下可形成多種酯類[25]，含量最豐富的為乙酸酯（乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯和2-乙酸苯乙酯），其次為飽和脂肪酸乙酯（丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯）[19]。從實驗結(jié)果得到，酒的風(fēng)味在很大程度上與酯類的組成及含量有關(guān)，Io發(fā)酵產(chǎn)生10.634 mg/L的總酯，而Sc發(fā)酵產(chǎn)生酯類總質(zhì)量濃度達19.832 mg/L，主要歸因于癸酸乙酯的高產(chǎn)，而癸酸乙酯會賦予酒體果香和酒香及白蘭地似的香韻。釀酒酵母細胞內(nèi)的EHT1和EEB1基因編碼醇?；D(zhuǎn)移酶，是酵母中鏈脂肪酸乙酯合成的關(guān)鍵基因，Sc純種發(fā)酵中辛酸乙酯、癸酸乙酯等酯類含量較高可能與EHT1基因的過量表達有關(guān)[26-27]。除癸酸乙酯和辛酸乙酯外，月桂酸乙酯也是Sc產(chǎn)生的特征風(fēng)味物質(zhì)，質(zhì)量濃度達到2.291 mg/L。相比Io發(fā)酵，混菌發(fā)酵使得癸酸乙酯、辛酸乙酯和月桂酸乙酯等含量顯著提高，還產(chǎn)生了癸酸異戊酯，增加了酒體香氣的復(fù)雜性。

30 種酯類物質(zhì)中，乙酸芳樟酯、醋酸-2-乙基己酯、反式-2-辛烯酸乙酯為Io發(fā)酵產(chǎn)生的特有風(fēng)味成分；而乙酸乙酯是Io的特征風(fēng)味物質(zhì)，其質(zhì)量濃度高達3.421 mg/L，約為Sc發(fā)酵含量的10 倍。文獻表明，乙酸乙酯的形成以乙醇為底物，而乙醇脫氫酶基因ADH1在乙醇發(fā)酵過程中將乙醛還原成乙醇，因此，Io對乙酸乙酯的合成能力與醇脫氫酶基因ADH1表達情況有關(guān)[26]。乙酸乙酯質(zhì)量濃度在100 mg/L以下時會賦予酒體令人愉快的芳香氣味，但如果質(zhì)量濃度過大，會使酒出現(xiàn)指甲油的氣味[28]。相比Sc純種發(fā)酵，混菌發(fā)酵使得乙酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯和辛酸異戊酸等呈味物質(zhì)含量有較大提高，使酒體口感豐滿。釀酒酵母中編碼醇?；D(zhuǎn)移酶的ATF1、ATF2表達量控制著乙酸酯類化合物在體內(nèi)合成，其中ATF1基因作用優(yōu)于ATF2基因[26]。Barbosa等[27]發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵過程中，乙酸乙酯、乙酸異戊酯等乙酸酯類含量的增加與發(fā)酵過程中釀酒酵母ATF1的高表達有關(guān)。

2.3.2 醇、醛、酮類物質(zhì)

高級醇是酵母菌乙醇發(fā)酵的副產(chǎn)物，高級醇合成主要是通過艾利希途徑將氨基酸作為底物轉(zhuǎn)氨脫羧再由醇脫氫酶還原而成如2-甲基-1-丁醇可由異亮氨酸轉(zhuǎn)化而來的，此外，酵母也能從糖代謝的碳片段形成高級醇[29]。實驗表明，純種發(fā)酵和混菌發(fā)酵共檢測出7 種高級醇，其中苯乙醇具有特殊的玫瑰香氣和先苦后甜的桃味，相比純種發(fā)酵，混菌發(fā)酵苯乙醇含量大量增加，達到11.737 mg/L，可能與ARO1、ARO7和ARO8等芳香族氨基酸合成相關(guān)基因的高表達有關(guān)[27]。此外，Sc合成高級醇的能力強于Io，可能是Sc具有較高的醇脫氫酶活力[30]。相比Io純種發(fā)酵，混合發(fā)酵高級醇含量提高了162%，2-甲基-1-丁醇、正丁醇和2-乙基己醇等含量有所增加?？赡茉蚴荌o在發(fā)酵后期的自溶為Sc提供營養(yǎng)物質(zhì)，或者Io具有某些酶活性，能夠為Sc提供營養(yǎng)來源[31]如果膠酶、淀粉酶和木聚糖酶[32]。混合發(fā)酵得到的高級醇質(zhì)量濃度在300 mg/L以下，能夠賦予酒體芳香味[33]。

另外，Io的存在使得發(fā)酵液中4-萜烯醇和苯乙酮含量增加，但值得注意的是在混菌發(fā)酵條件下，未檢測到壬醛（具有強烈的脂肪氣味）成分。

2.3.3 酸類及烯萜類物質(zhì)

乙酸含量是影響發(fā)酵酒質(zhì)量的一個重要因素，超過0.7 g/L會產(chǎn)生刺鼻氣味和不良口感[19]。3 種發(fā)酵液中，乙酸為Io發(fā)酵液所特有，質(zhì)量濃度較高，達到0.472 mg/L，也是以上結(jié)果分析中乙酸酯類含量較高的原因。乙酸的產(chǎn)生與維持細胞內(nèi)氧化還原平衡密切相關(guān)[34]，由此可解釋高糖等高滲透脅迫發(fā)酵條件下乙酸產(chǎn)生的原因。而Sc純種發(fā)酵液未能檢測到乙酸，與Io純種發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵也降低了發(fā)酵過程中乙酸質(zhì)量濃度。

己酸、辛酸、癸酸等中鏈脂肪酸（C6～C12）是酵母發(fā)酵過程中合成細胞膜所需長鏈脂肪酸的剩余片段，其積累對酵母的生長有毒性作用[19]。且己酸、辛酸和癸酸這3 種化合物會使酒體帶有不愉快氣味。其中，正癸酸是Sc發(fā)酵所特有的，正癸酸使得酒體有輕微腐臭味?；炀l(fā)酵后，正癸酸的含量降低至檢出限以下，同樣，混菌發(fā)酵使得己酸和辛酸含量也有所下降。

萜類化合物是自然界廣泛存在的一大類異戊二烯衍生物，對人體具有較強的生理活性[35]。3 種發(fā)酵方式的楊梅酒中共檢出3 種烯萜類化合物。Io純種發(fā)酵產(chǎn)生的烯萜類物質(zhì)質(zhì)量濃度最高，達到2.706 mg/L；相比純種發(fā)酵，混菌發(fā)酵后，除γ-芹子烯的含量稍有增加外，烯萜類物質(zhì)總體含量減少。

2.4 楊梅酒揮發(fā)性風(fēng)味成分主成分分析

表2 主成分特征值及其貢獻率Table 2 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance

由表2可知，第1主成分貢獻率為70.090%，第2主成分貢獻率為14.049%，2 個成分的累計貢獻率達到80%，所以2 個主成分能夠有效解釋變量信息。

由圖3a可知，第1主成分與乙酸乙酯等重要酯類、乙酸及反式石竹烯呈顯著正相關(guān)，與辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醇、苯甲醛等呈顯著負(fù)相關(guān)；第2主成分與反式-4-癸烯酸乙酯、正癸酸、壬醛呈正相關(guān)，與γ-芹子烯呈負(fù)相關(guān)。

由圖3b可知，3 種發(fā)酵楊梅酒分別位于不同象限可以反映出三者的整體風(fēng)味有較大差異。Io發(fā)酵酒在第1主成分上的得分較高，說明Io發(fā)酵酒乙酸乙酯、乙酸及反式石竹烯含量較高；Sc發(fā)酵酒在第2主成分上的得分較高，說明反式-4-癸烯酸乙酯、正癸酸、壬醛含量相對較高。而Sc發(fā)酵酒和混菌發(fā)酵酒在第1主成分上的得分接近可知兩者在風(fēng)味成分上相似度高，可能由于Io在發(fā)酵早期因為乙醇毒性等原因而消亡，而后起主導(dǎo)作用的Sc有效地影響混合發(fā)酵生產(chǎn)的楊梅酒香氣特征。

圖3 混菌發(fā)酵和純種發(fā)酵楊梅酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析圖Fig. 3 Principal component analysis score and loading plots of the volatile aroma compounds produced from pure and mixed-culture fermentations

2.5 整體感官評價分析

通過對不同發(fā)酵方式下楊梅酒風(fēng)味的感官評定，得出楊梅酒的主要香型為果香、甜香、酸味、乙醇味、澀味和酵母味，如圖4所示。除乙醇味以外，果香和酸味是Io發(fā)酵酒最主要的風(fēng)味，而酯類和酸類分別是貢獻果香和酸味的主要物質(zhì)。不同的酯類物質(zhì)在香氣感知時相互之間具有累加效應(yīng)，楊梅酒的果香來自于混合酯類的作用，但是果香感知的強度并不與總酯類含量呈正比，而與其間特殊的比例相關(guān)[36]，這也就解釋了雖然Sc產(chǎn)酯量最高，但是發(fā)酵液中果香味較弱的原因。不同的乙醇發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些雜醇類和直鏈脂肪酸如2-甲基丁醇、辛酸和正癸酸，賦予了Sc發(fā)酵酒特有的酵母味，這與定量結(jié)果一致。與Sc純種發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵提高了楊梅酒的果味強度，降低了發(fā)酵產(chǎn)生的酵母味和癸酸乙酯等帶來的澀味。

圖4 不同發(fā)酵方式下楊梅酒的感官評定雷達圖Fig. 4 Radar plots depicting the flavor profiles of Chinese bayberry wines produced by different fermentation methods

3 結(jié) 論

選用Io與Sc以10∶1的接種比例進行楊梅酒的混合發(fā)酵?；炀l(fā)酵增加了商業(yè)化釀酒酵母的發(fā)酵速率，使主發(fā)酵提早3 d完成。通過HS-SPME-GC-MS分析楊梅酒共檢測到59 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中含量較高的成分是辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇、反式石竹烯和2,3-環(huán)氧-4,4-二甲基戊烷?；炀l(fā)酵與Sc純種發(fā)酵相似度高，但減少了Sc發(fā)酵產(chǎn)生的辛酸及正癸酸這2 種不良氣味，也降低了Io產(chǎn)生的乙酸質(zhì)量濃度；Io的參與使混菌發(fā)酵液中丁酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、3-壬烯酸乙酯等乙酯類和乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯等乙酸酯類含量分別提高了18.52%和57.34%，增加了楊梅酒的果香味。不同菌種發(fā)酵楊梅酒口味之間有顯著差異，果香和酸味是Io發(fā)酵酒最主要的風(fēng)味，而Sc發(fā)酵酒有特有的酵母味，混菌發(fā)酵提高了楊梅酒的果味強度，降低了發(fā)酵產(chǎn)生的酵母味和癸酸乙酯等帶來的澀味。