超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定干紅葡萄酒中18 種花色素單體方法的建立

金 剛，楊志偉，王圣儀，王昶森，馬 雯，張進(jìn)杰，張 昂,*，張軍翔,*

（1.寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心，寧夏葡萄與葡萄酒研究院，寧夏葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021；3.秦皇島出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，河北 秦皇島 066004）

花色素是葡萄果皮的重要次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化的作用，針對老年病有著特殊的功效[1]，在抗糖尿病、預(yù)防老年癡呆、抗高血壓、抗炎、保護(hù)血管、動脈，抗突變、抗腫瘤[2-3]和癌癥等方面效果顯著[4]?；ㄉ仉S著葡萄酒釀制過程中的果實處理浸入干紅葡萄酒，是干紅葡萄酒中主要呈色物質(zhì)，常以糖苷形式存在，使其呈現(xiàn)出不同顏色，對葡萄酒顏色與顏色的穩(wěn)定性造成影響[5-6]。同時干紅葡萄酒中花色素的組成特征同樣包含品種產(chǎn)地、年份以及釀酒工藝、栽培方式、生態(tài)條件、陳釀時間等信息[7-8]，可以作為區(qū)分不同品種干紅葡萄酒的化學(xué)標(biāo)志，因此鑒定干紅葡萄酒中花色素的種類和含量對葡萄酒真?zhèn)舞b別及等級評定起重要作用。

花色素按照結(jié)構(gòu)可分為基本花色苷、?；ㄉ?、吡喃花色苷、聚合花色苷4 類[9-12]，其中基本花色苷主要有五錦葵花色素苷、芍藥花色素苷、矢車菊花色素苷、飛燕草花色素苷和矮牽?；ㄉ剀? 種形式[13]，分屬5 種糖苷配基。研究表明[14]，葡萄主要含有5 種花色素，分別為花青素（矢車菊素）、花翠素（飛燕草素）、3’-甲花翠素（矮牽牛素）、青甲?；ù渌兀ㄉ炙幩兀┖投谆ù渌兀ㄥ\葵素），以錦葵色素占主要比例，種類和含量根據(jù)葡萄所屬種和品種的不同而有所變化。在此基礎(chǔ)上，本實驗共整理出共18 種常見花色素單體作為干紅葡萄酒中檢測項。

目前國內(nèi)關(guān)于花色素的研究多為分離純化，對快速定量檢測研究較少，常見檢測方法包括pH示差法[15]、分光光度計法、液相色譜（liquid chromatography，LC）技術(shù)、高效液相色譜-質(zhì)譜[16-20]（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）技術(shù)等，蔣寶等[21]以晉西黃土高原地區(qū)4 個品種的干紅葡萄酒為研究對象，利用HPLC-MS對多種聚合花色苷及衍生物成分進(jìn)行分析，僅以二甲花翠素葡萄糖苷做內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行了定量分析；季梅等[22]通過HPLC-全波長紫外掃描-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對葡萄皮中花色苷進(jìn)行檢測，檢測的基本花色苷種類較少且未定量檢測；He Fei等[23]對歐亞種葡萄酒花色苷種類的檢測，利用HPLC-MS技術(shù)在葡萄酒樣品中共檢出36 種花色苷類物質(zhì)，未定量測定；Violeta等[24]利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)鑒定花色苷結(jié)構(gòu)，未進(jìn)行定量檢測。

干紅葡萄酒中利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術(shù)測定基礎(chǔ)花色苷單體及含量的研究鮮有報道，UPLC-MS/MS技術(shù)可以在HPLC-MS的基礎(chǔ)上進(jìn)行2 次質(zhì)量數(shù)篩選，盡可能降低背景噪音，提高檢測靈敏度，使定量更為準(zhǔn)確，以縮短檢測時間、分離能力強(qiáng)等優(yōu)點迅速發(fā)展[25-26]。本實驗采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立定性定量分析干紅葡萄酒中18 種花色素單體及含量的方法，以期為產(chǎn)地干紅葡萄酒相應(yīng)溯源標(biāo)準(zhǔn)的制定提供新思路，為干紅葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)和質(zhì)量檢測機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秦皇島市售120 種干紅葡萄酒。

18 種花色素單體標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%）：飛燕草色素（delphinidin，Del）、飛燕草素-3-葡萄糖苷（delphinidin-3-glucoside，Del-3-G）、飛燕草素-3,5-二葡萄糖苷（delphinidin-3,5-diglucoside，Del-3,5-D）、飛燕草素鼠李葡萄糖苷（delphinidin-3-O-rutinoside，Del-3-R）、矢車菊素（cyanidin，Cya）、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，Cya-3-G）、矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷（cyanidin-3,5-diglucoside，Cya-3,5-D）、天竺葵色素苷（pelargonin，Pel）、天竺葵素（pelargonidin，Pel-3-gal）、天竺葵素-3-葡萄糖苷（pelargonidin-3-O-glucoside，Pel-3-G）、芍藥素（peonidin，Peo）、芍藥苷-3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside，Peo-3-G）、芍藥素-3,5-二葡萄糖苷（peonidin-3,5-di-O-glucoside，Peo-3,5-D）、錦葵色素（malvidin，Mal）、錦葵色素-3,5-二葡萄糖苷（malvidin-3,5-diglucoside，Mal-3,5-D）、錦葵色素-3-半乳糖苷（malvidin-3-galactoside，Mal-3-G）、矮牽牛素（petunidin，Pet）、矮牽牛素-3-D-葡萄糖苷（petunidin-3-O-β-D-glucoside，Pet-3-G）美國Extrasynthese SA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

30A UPLC儀 日本島津公司；SCIEX QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源、Turbo V離子源和Analyst 1.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國AB Sciex公司；Phenyl-Hexyl色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm） 美國Waters公司；Milli-Q去離子水機(jī) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取1 mL干紅葡萄酒樣，用含5%甲醇的1%甲酸溶液稀釋500 倍，渦旋混合后吸取1 mL移至樣品瓶，為減少目標(biāo)物損失，未過濾膜。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)液配制

分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，用含5%甲醇的1%甲酸溶液溶解并定容至刻度，搖勻，制得100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃避光保存。

1.3.3 基質(zhì)液配制

將150 mL乙醇和3 g酒石酸移入1 L的容量瓶中，用去離子水定容，得到模擬酒樣，使用時取出適量模擬酒樣，再加入目標(biāo)濃度的花色素單體的單標(biāo)或混標(biāo)使用。

1.3.4 UPLC條件

柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積30 μL，流速0.25 mL/min，用Phenyl-Hexyl色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）分離，根據(jù)花色素單體性質(zhì)確定流動相A為含5%甲醇的1%甲酸溶液，流動相B為1%甲酸-甲醇溶液。洗脫程序：0～3.1 min，0%～65% B；3.1～8.0 min，65% B；8.0～8.5 min，65%～100% B；8.5～12.5 min，100% B；12.5～13 min，100%～0% B；13～20 min，0% B。

1.3.5 MS條件

電霧噴離子源，正離子模式；反應(yīng)監(jiān)測；離子掃描范圍m/z100～1 000；霧化器壓力345 kPa；輔助氣流速10 L/min；干燥氣溫度350 ℃；氣簾氣壓力30 psi；碰撞氣Mediun；離子噴霧電壓5 500 V；離子源溫度500 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

采用注射泵直接將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源的方式對18 種花色素單體質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。分別將質(zhì)量濃度為1 mg/L的18 種花色素單體標(biāo)準(zhǔn)工作液以10 μL/min流速注入離子源中，電霧噴離子源，正離子模式模式下對每種花色素單體進(jìn)行一級質(zhì)譜分析，對碰撞室射出電壓和去簇電壓進(jìn)行充分優(yōu)化，以確定準(zhǔn)分子離子峰。再進(jìn)行目標(biāo)離子二級掃描，優(yōu)化碰撞電壓，得到碎片離子。

分別選取經(jīng)碰撞后所得豐度較高、碎片結(jié)構(gòu)合理的2 個子離子作為定量和定性離子，確定其最佳碰撞能量。

2.2 色譜條件優(yōu)化

為提高花色素單體的離子化效率[27]，選擇含5%甲醇的0.5%～1.5%甲酸溶液作為流動相同時分析18 種花色素單體的峰形，確定在添加1%甲酸溶液時花色素單體的峰形最好，但保留時間基本相同，分離效果差。

在電霧噴離子源，正離子模式下，18 種花色素單體的質(zhì)譜參數(shù)見表1，分子結(jié)構(gòu)式見圖1，總離子流圖見圖2。

表1 18 種花色素單體質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 18 anthocyanin monomers

由表1和圖1、2可知，優(yōu)化后的18 種花色苷單體總離子流圖出峰響應(yīng)值高、靈敏度高、峰形標(biāo)準(zhǔn)，但這18 種花色素單體由于結(jié)構(gòu)極性相近，在色譜柱上無法得到分離，色譜柱僅起到將干擾物與待測物分離的作用，因此可以通過不同質(zhì)譜信息對這18 種花色素單體進(jìn)行鑒定和含量計算。

圖1 18 種花色素單體分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Molecular structures of 18 anthocyanidic monomers

圖2 18 種花色素單體總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of 18 anthocyanidic monomers

2.3 線性關(guān)系、檢出限及定量限測定結(jié)果

向1.3.4節(jié)模擬酒基質(zhì)液中定量添加18 種花色素單體的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在0.00、1.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00、500.00 μg/L 8 個水平下測定，以目標(biāo)化合物的峰面積（y）對其相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照1.3.5節(jié)樣品前處理方法制備干紅葡萄酒樣品，平行6 次實驗，分別在10.0、20.0、50.0 μg/L添加水平進(jìn)行添加，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，按3 倍信噪比得到目標(biāo)化合物的檢出限，10 倍信噪比得到目標(biāo)化合物的定量限，結(jié)果見表2。從表2可以看出，線性回歸系數(shù)R2均大于0.999，說明該種方法測定18 種花色素單體在1～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，為減小誤差，在實際樣品檢測時可根據(jù)實際情況取其中一段線性進(jìn)行定量。在低、中、高的添加水平范圍內(nèi)，18 種花色素單體回收率均在95%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于3%，說明上述樣品預(yù)處理方法可行，可以滿足日常樣品分析要求。

表2 方法學(xué)驗證Table 2 Methodological verification

2.4 實際樣品檢測

表3 實際樣品中花色素的測定結(jié)果（n=120）Table 3 Summary of analytical results for the determination of anthocyanins in real samples by the proposed method (n= 120)

為判定該方法的普遍性，對秦皇島市售120 種干紅葡萄酒進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表3，根據(jù)已檢測花色素單體在干紅葡萄酒中含量，繪制含量箱線圖，見圖3。

由表3可知，120 種干紅葡萄酒中共檢出16 種花色素單體，未檢出的花色苷單體為Pel-3-gal和Pel-3-G，花色苷單體總量在15 000～60 000 μg/L之間。干紅葡萄酒中花色苷含量從高到低排序為Mal、Mal-3-G、Del-3-G、Del、Mal-3,5-D、Peo-3-G、Peo、Del-3,5-D、Cya、Del-3-R、Pet、Peo-3,5-D、Pet-3-G、Cya-3-G、Cya-3,5-D、Pel。

圖3 干紅葡萄酒中花色素單體的含量分布Fig. 3 Distribution of anthocyanin monomers in wine

由圖3可知，16 種檢出花色素單體含量的中位數(shù)位置、四分位間距框的位置與高度基本相同，說明數(shù)據(jù)具有良好的對稱性，正常值分布比較集中，從16 種花色素單體含量的Whisker上限和下限看，Mal和Mal-3-G在紅葡萄酒中含量分布范圍很廣。

李琪等[28]利用HPLC技術(shù)測定甘肅地區(qū)9 種釀酒葡萄中花色素單體含量，認(rèn)為錦葵色素為釀酒葡萄中含量最高的花色素單體，與本實驗結(jié)論相同；張世杰等[29]利用HPLC技術(shù)同樣得到錦葵色素是干紅葡萄酒中主要花色素單體。

本實驗結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，并在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)另外2 種在干紅葡萄酒中含量較高的花色素單體，為Mal-3-G以及Del-3-G。Mal、Mal-3-G和Del-3-G在干紅葡萄酒中分別占花色素單體總量的31.01%、24.50%和12.22%，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[24]可知Mal在歐亞種釀酒葡萄釀制的干紅葡萄酒中含量約占50%，Mal-3-G在山葡萄釀制的紅葡萄酒中含量較高，由此可以推測，120 種市售干紅葡萄酒有部分葡萄酒在釀制過程中加入山葡萄釀造。

3 結(jié) 論

本實驗采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立干紅葡萄酒中18 種花色素單體定性定量的檢測方法，通過儀器條件、稀釋液和流動相、色譜柱的優(yōu)化，最終得到方法的檢出限在0.2～3.5 μg/L之間，定量限在0.4～11.5 μg/L之間，加標(biāo)回收率在95%～100%之間。

這種檢測方法操作簡便、靈敏度高、實用性強(qiáng)，相比于已有方法[30]，檢測時間短且檢出限低，經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法能滿足干紅葡萄酒中18 種花色素單體的日常檢測要求，可應(yīng)用于干紅葡萄酒日常監(jiān)測工作。