高鹽稀態(tài)釀造醬油中香氣活性成分在滅菌前后的變化

康文麗，陳 亮，賀 博，吳 燦，周尚庭*

（加加食品集團(tuán)股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410600）

醬油是起源于我國(guó)的傳統(tǒng)調(diào)味品，如今其產(chǎn)銷(xiāo)量和生產(chǎn)企業(yè)規(guī)模均居調(diào)味品行業(yè)首位[1]。在醬油生產(chǎn)過(guò)程中，需要對(duì)醬油進(jìn)行加熱滅菌處理，常用的方式有2 種，一種是采用巴氏殺菌，另一種是采用高溫瞬時(shí)殺菌。醬油的香氣是衡量質(zhì)量的重要指標(biāo)，而關(guān)于醬油滅菌前后香氣變化的研究報(bào)道較少。Steinhaus等[2]研究了日本醬油在145 ℃加熱20 min前后香氣的變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)加熱后會(huì)新生成糠硫醇、2-乙?；?2-噻唑啉和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，同時(shí)2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、3-甲基丁醇和葫蘆巴內(nèi)酯的含量降低，而苯乙醛含量增加；Kaneko等[3]研究了日本真空包裝醬油在80 ℃加熱30 min前后香氣變化，研究結(jié)果表明多數(shù)關(guān)鍵香氣成分含量經(jīng)過(guò)加熱以后都略有升高，而4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚含量增加最為顯著；Meng Qi等[4]研究了日本醬油中具有果香的5 種酯類(lèi)關(guān)鍵香氣成分在80 ℃加熱30 min前后的變化情況，研究結(jié)果表明經(jīng)過(guò)加熱后5 種酯類(lèi)關(guān)鍵香氣物質(zhì)含量均降低；以上研究均對(duì)醬油進(jìn)行了較長(zhǎng)時(shí)間的加熱處理。

分析醬油中香氣成分在殺菌前后的變化情況，首先需要對(duì)其中的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，目前可用于提取醬油中的揮發(fā)性成分的方法主要有水蒸氣蒸餾[5]、同時(shí)蒸餾萃取[6]、溶劑直接萃取[7]、吹掃捕集[8]、固相微萃取[9]、溶劑萃取結(jié)合溶劑輔助風(fēng)味成分蒸發(fā)[10]。采用水蒸氣蒸餾和同時(shí)蒸餾萃取法時(shí)需要對(duì)樣品進(jìn)行加熱，加熱過(guò)程中會(huì)生成新的成分；溶劑直接萃取所得提取物中常含有不揮發(fā)或難揮發(fā)性成分，直接分析會(huì)影響色譜柱的壽命；采用吹掃捕集進(jìn)行提取時(shí)，影響吹掃效率的因素較多；固相微萃取只是選擇性吸附，萃取纖維的種類(lèi)直接影響提取效果；溶劑萃取結(jié)合溶劑輔助風(fēng)味成分蒸發(fā)是目前國(guó)際上公認(rèn)的提取揮發(fā)性成分比較好的方法，本實(shí)驗(yàn)將采用溶劑萃取結(jié)合溶劑輔助風(fēng)味成分蒸發(fā)法提取高鹽稀態(tài)釀造醬油經(jīng)過(guò)高溫瞬時(shí)殺菌前后的揮發(fā)性成分，利用分子感官科學(xué)的方法研究其中香氣活性物質(zhì)的變化情況，為改進(jìn)醬油生產(chǎn)工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

未滅菌的高鹽稀態(tài)釀造醬油樣品由加加食品集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，主要原料包括豆粕、小麥、鹽。

己醛（純度98%）、3-甲基-1-丁醇（純度99%）、2,5-二甲基吡嗪（純度99%）、乙酸（純度99%）、3-甲硫基丙醛（純度95%）、芳樟醇（純度98%）、丁酸（純度99%）、3-甲基丁酸（純度99%）、3-甲硫基丙醇（純度98%）、甲基環(huán)戊烯醇酮（純度99%）、愈創(chuàng)木酚（純度99%）、苯乙醇（純度99%）、麥芽酚（純度99%）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（純度99%）、丁香酚（純度98%）、4-乙基苯酚（純度98%）、2-辛醇（純度99%）北京百靈威科技有限公司；4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮（純度98%）、2,6-二甲氧基苯酚（純度98%）、苯乙醛（純度95%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-乙基-3,5-二甲基吡嗪（純度99%）、糠醇（純度＞98%） 北京華威銳科化工有限公司；5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮（純度＞98%） 藤州瑞元香料有限公司；香蘭素（純度99%） 北大正元香料公司；C6～C30正構(gòu)烷烴（色譜純） 美國(guó)Supelco公司；二氯甲烷、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、碳酸鈉、鹽酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯乙酸（純度96%）由苯乙酰氯水解制得。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、7890B GC儀美國(guó)安捷倫公司；Sniffer3000嗅覺(jué)（olfactometry，O）檢測(cè)器 德國(guó)Gerstel公司；蝶形玻璃儀器 莘縣京興玻璃器皿有限公司；TIC-6i型高真空泵組 英國(guó)Edwards公司；DKB-501A型超級(jí)恒溫水槽 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將未滅菌的高鹽稀態(tài)釀造醬油在120 ℃加熱滅菌15 s，得到滅菌后高鹽稀態(tài)釀造醬油。

1.3.2 樣品香氣評(píng)價(jià)

參照GB/T 14454.2—2008《香料香氣評(píng)定法》，用評(píng)香條蘸取未滅菌和滅菌的高鹽稀態(tài)釀造醬油樣品，對(duì)其香氣進(jìn)行評(píng)價(jià)[11]。

1.3.3 液液萃取結(jié)合溶劑輔助風(fēng)味成分蒸發(fā)法提取醬油中的揮發(fā)性成分

取100 mL醬油樣品和50 mL重蒸的二氯甲烷放入錐形瓶中，200 r/min室溫?fù)u床1 h，結(jié)束后將醬油和二氯甲烷混合液4 ℃、8 000 r/min離心5 min，將下層有機(jī)層和上層醬油層進(jìn)行分離。在分離出的醬油中繼續(xù)加入二氯甲烷，重復(fù)以上操作，共萃取3 次，合并有機(jī)相得到萃取液。用溶劑輔助風(fēng)味成分蒸發(fā)法將萃取液中的揮發(fā)性成分與非揮發(fā)性成分進(jìn)行分離；首先在蝶形玻璃儀器的一側(cè)加料漏斗中加入萃取液，其下接收瓶放入40 ℃水浴中，另一側(cè)加入液氮進(jìn)行冷凝，其下接收瓶液氮冷卻，當(dāng)真空泵壓力為2.5×10-5mbar時(shí)開(kāi)始滴加萃取液，滴加完畢后繼續(xù)抽真空1 h，在液氮冷卻的接收瓶中得到揮發(fā)性組分。

為了便于分析，將得到的揮發(fā)性組分分為酸性組分和中堿性組分。取10.8 g無(wú)水碳酸鈉放入200 mL去離子水中攪拌溶解，每次取100 mL碳酸鈉溶液對(duì)由溶劑輔助風(fēng)味成分蒸發(fā)得到的揮發(fā)性組分進(jìn)行洗滌，分出有機(jī)相，然后再用飽和氯化鈉溶液洗滌（50 mL×2）有機(jī)相，得到的有機(jī)相即為中堿性組分，加入無(wú)水硫酸鈉置于-20 ℃冰箱中過(guò)夜；在水相中逐漸加入鹽酸溶液（由30 mL去離子水和30 mL鹽酸配制）調(diào)節(jié)溶液pH值至1～2，用二氯甲烷（50 mL×3）進(jìn)行萃取，得到二氯甲烷萃取物，合并萃取物得到酸性組分，加入無(wú)水硫酸鈉置于-20 ℃冰箱中過(guò)夜。隨后，將酸性組分或中堿性組分用韋氏蒸餾柱進(jìn)行蒸餾、氮吹濃縮至0.5 mL，采用GC-O和GC-MS聯(lián)用儀對(duì)所得濃縮物進(jìn)行分析。

1.3.4 GC-O分析條件

G C條件：D B-W A X極性毛細(xì)管色譜柱（30.0 m×250 μm，0.25 μm）；程序升溫：色譜柱起始溫度為40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速率升至80 ℃，之后以4 ℃/min的速率升至100 ℃，最后以6 ℃/min的速率升至230 ℃，保持5 min；載氣He，載氣流量1.0 mL/min[12]；進(jìn)樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，嗅聞口溫度220 ℃，經(jīng)色譜柱分離后的組分以1∶2分別進(jìn)入氫離子火焰檢測(cè)器和嗅覺(jué)檢測(cè)器；進(jìn)樣量1 μL，采用不分流模式。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由3 名經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的嗅聞人員對(duì)樣品進(jìn)行嗅聞，對(duì)嗅聞到的香氣區(qū)域、保留時(shí)間以及香氣強(qiáng)度進(jìn)行記錄，每人每個(gè)樣品重復(fù)2～3 次，2 人以上嗅聞到的香氣給予記錄。

1.3.5 GC-MS分析條件

GC條件：與GC-O分析中的GC條件相同。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；掃描模式為Scan；質(zhì)量掃描范圍33～350 u。

1.3.6 定性與定量

定性分析：通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的香氣特征、質(zhì)譜和保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)的方法對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行定性。

定量分析：采用2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法對(duì)香氣活性成分進(jìn)行定量，其中以香氣活性物質(zhì)的濃度與內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)（x），以二者的面積比為縱坐標(biāo)（y）。

1.3.7 香氣活性值的計(jì)算

香氣活性值（odor activity value，OAV）等于香氣活性物質(zhì)在醬油中的濃度與其自身在水中閾值的比值；OAV大于1的香氣活性物質(zhì)對(duì)醬油的香氣輪廓貢獻(xiàn)大，被認(rèn)為是醬油的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣評(píng)價(jià)結(jié)果

經(jīng)過(guò)香氣評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)滅菌前后的醬油樣品的整體香氣特征接近，滅菌前的醬油頭香中的煙熏香氣突出；但是滅菌后的醬油頭香中豆的青香和甜香，以及體香和基香中的醬香與焦甜均較未滅菌樣品的強(qiáng)，且香氣強(qiáng)度大，留香時(shí)間較長(zhǎng)。

2.2 香氣活性物質(zhì)的鑒定

經(jīng)過(guò)GC-O分析，共嗅聞到24 種香氣活性區(qū)域，利用香氣特征、質(zhì)譜和保留指數(shù)對(duì)嗅聞到的香氣進(jìn)行初步定性，然后經(jīng)過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)數(shù)據(jù)和香氣特征進(jìn)行比對(duì)定性，見(jiàn)表1。

表1 滅菌前后醬油中香氣活性成分Table 1 Odor-active compounds identi fi ed in soy sauce before and after sterilization

從表1可以看出，乙酸、丁酸、3-甲基丁酸、麥芽酚、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、丁香酚、香蘭素、苯乙酸只在酸性組分中被嗅聞到，而2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪只在堿性組分中被嗅聞到。在鑒定出的24 種香氣活性物質(zhì)中醇類(lèi)5 種、酸類(lèi)4 種、醛類(lèi)4 種、酮類(lèi)4 種、酚類(lèi)5 種、吡嗪類(lèi)2 種。

鑒定出的5 種醇類(lèi)香氣活性物質(zhì)中包括3-甲基-1-丁醇、芳樟醇、糠醇、3-甲硫基丙醇和苯乙醇，其中3-甲基-1-丁醇、3-甲硫基丙醇和苯乙醇作為香氣活性物質(zhì)曾在中國(guó)醬油和日本醬油中被鑒定出[2,13-14]，它們可由醬油生產(chǎn)過(guò)程中所使用的酵母菌通過(guò)Ehrlich途徑代謝產(chǎn)生，其前體物質(zhì)是亮氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸[15]；糠醇可由發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的葡萄糖經(jīng)過(guò)氧化、脫羧和脫水形成[16]；意大利青霉菌可將酪蛋白氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)變成芳樟醇[17]。鑒定出的4 種酸類(lèi)香氣活性物質(zhì)中包括乙酸、丁酸、3-甲基丁酸和苯乙酸，作為香氣活性物質(zhì)它們都曾在醬油中被鑒定出[10,14]，其中乙酸和丁酸可以由醬油生產(chǎn)過(guò)程中所使用的乳酸菌代謝產(chǎn)生[18]，3-甲基丁酸被認(rèn)為是酵母蛋白代謝的副產(chǎn)物[19]。鑒定出的4 種醛類(lèi)香氣活性物質(zhì)分別為己醛、苯乙醛、3-甲硫基丙醛和香蘭素，己醛可由生產(chǎn)醬油時(shí)所使用的大豆或豆餅中的不飽和脂肪酸降解產(chǎn)生[20]；苯乙醛和3-甲硫基丙醛可由苯丙氨酸和蛋氨酸通過(guò)酵母的Ehrlich代謝途徑產(chǎn)生[15]，也可以通過(guò)Strecker降解產(chǎn)生[21]；香蘭素可由阿魏酸降解產(chǎn)生[22]，因?yàn)樯a(chǎn)醬油時(shí)會(huì)使用小麥或小麥麩皮，而其中均含有阿魏酸。鑒定出的4 種酮類(lèi)香氣活性物質(zhì)分別為甲基環(huán)戊烯醇酮、麥芽酚、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮；其中4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮既可以由還原糖與氨基酸通過(guò)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，也可由酵母代謝產(chǎn)生[2,10,23-24]；甲基環(huán)戊烯醇酮可由果糖降解產(chǎn)生[25]。鑒定出的5 種酚類(lèi)香氣活性物質(zhì)分別為愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、丁香酚、2,6-二甲氧基苯酚和4-乙基苯酚；作為香氣活性物質(zhì)愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2,6-二甲氧基苯酚和4-乙基苯酚都曾在日本醬油中鑒定出，被認(rèn)為是酵母發(fā)酵產(chǎn)生或者是阿魏酸降解產(chǎn)生[10]。鑒定出的2 種吡嗪類(lèi)香氣活性物質(zhì)分別為2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，主要通過(guò)美拉德反應(yīng)生成[26]。

2.3 香氣活性物質(zhì)定量結(jié)果

由表2可知，香氣活性物質(zhì)的總質(zhì)量濃度在滅菌后略有降低（由57 629.37 μg/L降為51 229.57 μg/L）；醇類(lèi)物質(zhì)整體質(zhì)量濃度呈降低趨勢(shì)（由7 622.66 μg/L降為4 921.17 μg/L），而糠醇質(zhì)量濃度有所增加；在加熱過(guò)程中醇類(lèi)物質(zhì)可以被氧化成醛（3-甲硫基丙醛和苯乙醛質(zhì)量濃度有所增加）或與酸反應(yīng)生成酯，使其質(zhì)量濃度降低；糠醇可由葡萄糖經(jīng)氧化、脫羧和脫水形成[16]，加熱有利于其形成。酸類(lèi)物質(zhì)整體質(zhì)量濃度也呈現(xiàn)降低趨勢(shì)（由31 059.27 μg/L降為23 818.51 μg/L），在加熱過(guò)程中酸類(lèi)物質(zhì)可與醇反應(yīng)生成酯類(lèi)物質(zhì)（由于酯類(lèi)物質(zhì)一般閾值較高，在GC-O分析中沒(méi)有被嗅聞到）使其質(zhì)量濃度降低。醛類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量濃度都呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，因?yàn)槠渲饕勺陨淼那绑w物質(zhì)通過(guò)降解產(chǎn)生，溫度升高有利于降解反應(yīng)，使其質(zhì)量濃度升高。酮類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量濃度整體呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)（由16 623.71 μg/L升為19 753.97 μg/L），但甲基環(huán)戊烯醇酮質(zhì)量濃度有所降低；經(jīng)過(guò)加熱滅菌處理以后4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮的質(zhì)量濃度升高，與Steinhaus等[2]研究結(jié)果一致；麥芽酚可由還原性二糖降解產(chǎn)生[27]，加熱有利于其產(chǎn)生；甲基環(huán)戊烯醇酮（3-甲基-2-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮）的含量有所降低可能與其自身結(jié)構(gòu)有關(guān)，它存在3 種互變異構(gòu)體，溫度升高加速了異構(gòu)體之間的互變，使其含量降低。酚類(lèi)物質(zhì)整體含量略有降低（由593.58 μg/L降為448.03 μg/L），而其中4-乙基苯酚的質(zhì)量濃度有所升高（由49.92 μg/L升為59.32 μg/L）；Kaneko等[3]在研究日本醬油在加熱前后香氣的變化時(shí)所得結(jié)果也表明不同酚類(lèi)物質(zhì)含量變化不同。在滅菌前后吡嗪類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量濃度基本沒(méi)有變化，這與其主要通過(guò)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，滅菌加熱時(shí)間較短有關(guān)。

表2 滅菌前后醬油中香氣活性成分Table 2 Concentrations of aroma-active compounds identi fi ed in soy sauce before and after sterilization

2.4 鑒定出的香氣活性物質(zhì)的OAV

表3 滅菌前后醬油中香氣活性成分OAVTable 3 OAVs of AACs identified in soy sauce before and after sterilization

如表3所示，在滅菌前后的樣品中均有18 種香氣活性物質(zhì)OAV大于1，它們是醬油樣品的關(guān)鍵香氣成分，但是滅菌后樣品的總OAV增加；鑒定出的24 種香氣活性物質(zhì)中有6 種（糠醇、乙酸、丁酸、苯乙酸、甲基環(huán)戊烯醇酮和2,5-二甲基吡嗪）在滅菌前后的樣品中OAV均小于1，它們對(duì)樣品的整體香氣貢獻(xiàn)較小；有5 種（2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、3-甲基丁酸、3-甲基-1-丁醇、丁香酚、2,6-二甲氧基苯酚）物質(zhì)OAV大于1，但滅菌前后無(wú)變化，對(duì)2 個(gè)樣品香氣差別基本沒(méi)有影響；有5 種（包括愈創(chuàng)木酚、3-甲硫基丙醇、芳樟醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚和苯乙醇）物質(zhì)在滅菌后的樣品中的OAV降低，其中愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚具有煙熏香，OAV降低是滅菌后樣品煙熏香氣減弱的原因；有8 種（3-甲硫基丙醛、麥芽酚、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、苯乙醛、己醛、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、4-乙基苯酚和香蘭素）物質(zhì)在滅菌后的樣品中OAV升高。3-甲硫基丙醛具有煮土豆香、醬香，是醬油的醬香特征香氣成分之一，OAV由2 869增加至3 797，使得滅菌后樣品的醬香、煮土豆香氣增強(qiáng)；麥芽酚、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮（俗稱(chēng)醬油酮）和4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮（俗稱(chēng)菠蘿酮），具有焦糖香，是醬油焦糖香特征香氣的主要成分，OAV增加，使滅菌后樣品的焦糖香增強(qiáng)；己醛具有青香和油脂香，它的OAV由25增加至35，使得滅菌后樣品的香氣透發(fā)；香蘭素具有香莢蘭和奶甜香，它的OAV增加是滅菌后樣品甜香增強(qiáng)的原因之一；OAV的結(jié)果與香氣評(píng)價(jià)的結(jié)果一致。結(jié)合OAV和定量結(jié)果可知3-甲硫基丙醛、麥芽酚、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、愈創(chuàng)木酚、3-甲硫基丙醇、芳樟醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚、苯乙醛、己醛等在滅菌前后樣品中的質(zhì)量濃度差別是導(dǎo)致醬油滅菌前后香氣差別的主要原因。

3 結(jié) 論

采用液液萃取結(jié)合溶劑輔助風(fēng)味成分蒸發(fā)法提取醬油滅菌前后樣品中的揮發(fā)性成分，提取物經(jīng)過(guò)GC-O分析，共鑒定出24 種香氣活性物質(zhì)，其中醇類(lèi)5 種、酸類(lèi)4 種、醛類(lèi)4 種、酮類(lèi)4 種、酚類(lèi)5 種、吡嗪類(lèi)2 種。

通過(guò)對(duì)鑒定出的24 種香氣活性物質(zhì)進(jìn)行定量分析和OAV計(jì)算，發(fā)現(xiàn)在滅菌前后的樣品中均有18 種香氣活性物質(zhì)OAV大于1，是樣品的關(guān)鍵香氣物質(zhì)；其中關(guān)鍵香氣物質(zhì)中的3-甲硫基丙醛、麥芽酚、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、愈創(chuàng)木酚、3-甲硫基丙醇、芳樟醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚、苯乙醛、己醛等在滅菌前后樣品中的質(zhì)量濃度差別是導(dǎo)致醬油滅菌前后香氣差別的主要原因。