李陽 王繼彤 劉曉露 田靜 賈錚 肖志明 樊霞

摘 要 ：建立了適用于大腸桿菌胞內(nèi)代謝物組學(xué)分析的樣品前處理?xiàng)l件。大腸桿菌菌體細(xì)胞采用冷凍鹽水（0.85% NaCl，80℃預(yù)冷15 min）進(jìn)行猝滅，猝滅后的菌體細(xì)胞經(jīng)過真空冷凍干燥，再通過液氮冷凍研磨結(jié)合超聲裂解的方式通透細(xì)胞膜，最后采用冷甲醇水（MeOHH2O，1∶1，V/V，4℃）提取胞內(nèi)代謝物。分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和OD值回收率從單細(xì)胞水平和整體水平評(píng)價(jià)猝滅溶劑對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜損傷影響。結(jié)果表明，采用冷凍鹽水猝滅大腸桿菌細(xì)胞損傷率小于5%。采用液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜（T3和Hilic 2種色譜分離結(jié)合ESI±掃描模式）檢測(cè)結(jié)果中低碰撞能量提取出的峰數(shù)量和總離子強(qiáng)度評(píng)價(jià)了3種細(xì)胞通透方式和4種提取溶劑組合的胞內(nèi)代謝物提取效果。結(jié)果表明，冷凍研磨結(jié)合超聲裂解通透細(xì)胞膜、冷甲醇水提取代謝物測(cè)得的代謝物數(shù)量最多（≥105），并且總離子強(qiáng)度在最優(yōu)范圍（106～107）內(nèi)。本研究采用冷凍干燥、冷凍研磨和超聲萃取相結(jié)合的代謝物提取方式，有效促進(jìn)了細(xì)胞膜裂解，提高了代謝物提取效率。本研究建立的前處理?xiàng)l件適用于大腸桿菌胞內(nèi)代謝物組學(xué)分析。

關(guān)鍵詞 ：大腸桿菌; 胞內(nèi)代謝物; 組學(xué)分析; 樣品前處理

1 引 言

隨著分離、分析技術(shù)和計(jì)算機(jī)信息學(xué)的不斷發(fā)展，代謝組學(xué)技術(shù)日趨成熟和進(jìn)步，已被應(yīng)用到多個(gè)領(lǐng)域。由于微生物在生物體系中具有重要地位，開展微生物代謝組學(xué)研究受到廣泛關(guān)注，并形成具有獨(dú)特性和系統(tǒng)性的研究策略[～3]。利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)所有低分子質(zhì)量的代謝物（包括代謝中間產(chǎn)物、激素、信號(hào)分子和次生代謝產(chǎn)物）同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，獲得高通量代謝物結(jié)果信息，再利用化學(xué)計(jì)量學(xué)建模和預(yù)測(cè)，進(jìn)而了解相關(guān)代謝途徑調(diào)控和變化的關(guān)鍵信息，為深入了解微生物代謝調(diào)控提供了更直接的技術(shù)手段[4，5]。微生物代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容是樣品前處理、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析和生物學(xué)活性和功能分析歸屬，其中樣品前處理是實(shí)驗(yàn)的第一步，也是關(guān)鍵的一步[6]。微生物代謝組學(xué)樣品前處理包括受試菌的復(fù)蘇和培養(yǎng)、菌體細(xì)胞猝滅、細(xì)胞膜通透以及代謝物提取[7]等。由于不同受試微生物生物活性和生理結(jié)構(gòu)不完全相同，所采用的前處理?xiàng)l件各異。目前尚無通用的標(biāo)準(zhǔn)方法能夠適用于所有微生物樣品前處理。菌體細(xì)胞猝滅是樣品前處理過程中至關(guān)重要的實(shí)驗(yàn)步驟，已報(bào)道的猝滅方式包括有機(jī)試劑法[8]、極端pH法[9]、快速過濾法[0]和冷溶劑猝滅法[1]。其中高濃度有機(jī)試劑或極端pH條件容易造成微生物細(xì)胞膜破裂，進(jìn)而導(dǎo)致胞內(nèi)代謝物泄漏?？焖龠^濾方式操作不便，如果濾紙孔徑太大會(huì)影響菌體收集數(shù)量，濾紙孔徑過小導(dǎo)致濾膜堵塞，過濾時(shí)間延長。冷溶劑猝滅是溫和、高效的猝滅方式，能夠瞬間抑制細(xì)胞內(nèi)代謝酶活性，將細(xì)胞代謝“凍結(jié)”在某一時(shí)間點(diǎn)[2]。需要注意的是， 使用低溫溶劑同樣需要考慮菌體細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致胞內(nèi)代謝物泄漏。細(xì)胞通透的目的是將細(xì)胞膜打開，使代謝物全部釋放，以便于后續(xù)提取。目前，應(yīng)用較多的通透方式為反復(fù)凍溶和超聲處理[3，14]。代謝產(chǎn)物提取則應(yīng)根據(jù)關(guān)注的代謝物溶解特性選擇最適提取試劑，最大限度將代謝物提取出來。同時(shí)，選擇提取溶劑時(shí)還應(yīng)考慮代謝物穩(wěn)定性、提取溶劑是否容易去除， 以及提取溶劑與儀器分析系統(tǒng)的兼容性。

大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）遺傳背景清楚且培養(yǎng)條件簡單，是各種生物化學(xué)、生物技術(shù)研究的重要模式生物[5]。開展E. coli代謝組學(xué)研究可為更深入地闡明E. coli代謝調(diào)控機(jī)理提供新的解決途徑。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)[5]和OD值回收率[6]評(píng)價(jià)了不同低溫猝滅溶劑對(duì)E. coli細(xì)胞損傷的影響，利用飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果中低碰撞能量下的出峰數(shù)量和總離子強(qiáng)度評(píng)價(jià)了不同細(xì)胞通透方式和提取溶劑組合的代謝物提取效果。通過比較優(yōu)化，確定了適用于E. coli胞內(nèi)代謝物組學(xué)分析的細(xì)胞猝滅溶劑和代謝物提取溶劑，提出了猝滅細(xì)胞冷凍干燥后冷凍研磨結(jié)合超聲萃取的代謝物提取方式，在細(xì)胞猝滅過程中最大程度避免細(xì)胞膜損傷，提取過程中有效促進(jìn)細(xì)胞壁破裂，提高了胞內(nèi)代謝物提取效率， 此條件能夠滿足E. coli代謝組學(xué)分析要求。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

References

1 Aldridge B B， Rhee K Y. Curr. Opin. Microbiol.， 2014， 19： 90-96

2 ZHOU HongWei， TAN FengYi， ZHONG Yin， LUAN TianGang. Chinese J. Anal. Chem.，? 2007，? 35（2）： 309-314

周宏偉， 譚鳳儀， 鐘 音， 欒天罡. 分析化學(xué)， 2007，? 35（2）： 309-314

3 YU Wei， GAO JiaoQi， ZHOU YongJin. Chinese Journal of Chromatography， 2019， 37（8）： 798-805

禹 偉， 高教琪， 周雍進(jìn). 色譜， 2019， 37（8）： 798-805

4 Gulik W M V， Andre B C， Seifar R M， Heijnen J J. Metabolomics in Practice. Weinheim： WileyVCH Verlag GmbH & Co KGaA， 2013： 1-19

5 Heberling C， Dhurjati P. Int. J. Mol. Sci.，? 2015，? 16： 8949-8967

6 Wang X， Xie Y， Gao? P， Zhang S， Tan H， Yang? F， Lian? R， Tian J， Xu G. Anal. Biochem.，? 2014，? 451： 48-55

7 Patejko M， Jacyna J， Markuszewski M J. J. Chromatogr.，? 2017，? 1043： 150-157

8 Tian J， Sang P， Gao P， Fu， R， Yang D， Zhang L， Zhou J， Wu S， Lu X， Li Y， Xu G. J. Sep. Sci.，? 2009，? 32（13）： 2281-2288

9 Li X， Long D， Ji J， Yang W， Zeng Z， Guo S， Ji Z， Qi G， Chen S. J. Microbiol. Meth.，? 2013，? 94： 61-67

10 Kim S， Lee D Y， Wohlgemuth G， Park H S， Fiehn O， Kim K H. Anal. Chem.，? 2013，? 85（4）： 2169-2176

11 TaymazNikerel H， de Mey M， Ras C， ten Pierick A， Seifar R M， Van Dam J C， Heijnen J J， Van Glilik W M. Anal. Biochem.，? 2009，? 386： 9-19

12 Baran R， Bowen B P， Northen T R. Mol. Biosyst.，? 2011，? 7（12）： 3200-3206

13 LI JingJing， JI GuoZhen， GAO AiWu， CAO Ping， YANG JinLi， WANG HaiRong. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，? 2017，? 44（3）： 651-658

李晶晶， 冀國珍， 高愛武， 曹 平， 楊金麗， 王海榮.? 中國畜牧獸醫(yī)，? 2017，? 44（3）： 651-658

14 Ohashi Y， Hirayama A， Ishikawa T， Nakamura S， Shimizu K， Ueno Y， Tomita M， Soga T. Mol. Biosyst.，? 2008，? 4（2）： 135-147

15 YE YangFang， ZHANG LiMin， AN YanPeng， HAO FuHua， TANG HuiRu. Chinese J. Anal. Chem.，? 2011，? 39（8）： 1186-1194

葉央芳， 張利民， 安艷捧， 豪富華， 唐惠儒.? 分析化學(xué)，? 2011，? 39（8）： 1186-1194

16 FAN XuJia， BIAN YanHui， YIN HaiSong， QIAO ChangSheng. Biotechnology Bulletin，? 2016，? 32（6）： 54-59

范栩嘉， 邊艷慧， 殷海松， 喬長晟.? 生物技術(shù)通報(bào)，? 2016，? 32（6）： 54-59