許佳瑤 陳俏麗 張瑞芝 李丹蕾

摘 要：泛素途徑可以調(diào)節(jié)許多關(guān)鍵的細胞功能。為探究松材線蟲中是否存在泛素途徑以及泛素途徑中的關(guān)鍵酶基因—泛素結(jié)合酶基因ubc3，構(gòu)建松材線蟲cDNA文庫，并進行測序、ORF分析、同源性分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、蛋白相互作用預(yù)測和分子動力學(xué)模擬等工作?？寺〉介L度為957bp的Bx-ubc-3基因片段。隨后的序列分析表明，其開放閱讀框長度為738 bp，編碼245個氨基酸;氨基6酸同源性分析結(jié)果表明，Bx-UBC-3與已知的泛素結(jié)合酶高度同源;蛋白互作和分子對接分析及分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明，Bx-UBC-3的結(jié)合位點位于一個α螺旋、一個Loop1（L1）環(huán)與一個Loop2（L2）環(huán);形成硫酯的Cys103位于L2上，構(gòu)成催化裂隙;Bx-UBC-3和Bx-Rbx1之間以及Bx-UBC-3和Bx-泛素之間形成氫鍵。這些結(jié)果表明松材線蟲中存在一條理論泛素通路，其中的關(guān)鍵酶Bx-UBC-3是開發(fā)高效抗線蟲生物藥劑的潛在靶標。

關(guān)鍵詞：松材線蟲;泛素結(jié)合酶3;E2;泛素途徑

中圖分類號：S763.11 ? ?文獻標識碼：A ? 文章編號：1006-8023（2019）05-0009-07

Abstract：The ubiquitin pathway is able to regulate many critical cellular functions. In order to explore the existence of the ubiquitin pathway and a key enzyme gene in ubiquitin pathway， ubiquitin-conjugating enzyme named as ubc3 in B. xylophilus， a cDNA library of B. xylophilus was constructed and sequenced， ORF analysis， homology analysis， phylogenetic tree construction， protein interaction prediction， docking and molecular dynamics simulation were carried out. The full-length cDNA generated by the nematode spliced leader method was 957 bp. Analysis of the Bx-ubc-3 cDNA sequence indicated that its open reading frame （ORF） was 783 bp and 245 amino acids were encoded. Comparison of the identified amino acid sequence with the current databases revealed extensive homology of Bx-ubc-3 to all known ubiquitin-conjugating enzymes. The modeling and prediction of protein interaction， docking and molecular dynamics simulations showed that the binding sites in Bx-ubc-3 were located in α helix， Loop 1 （L1） ring and Loop 2 （L2） ring. The thioester-forming Cys103， which was located in L2， constituted a catalytic cleft. The interfaces of Bx-ubc-3 to Bx-Rbx1 and Bx-ubc-3 to Bx-Ubiquitin were also supported by several obvious hydrogen bond interactions. Results show that there is a theoretic ubiquitin pathway in B. xylophilus， and support the notion that Bx-ubc-3 is a potential target for developing potent antinematodal drugs against B. xylophilus.

Keywords：Bursaphelenchus xylophilus; ubiquitin-conjugating enzyme 3; E2; ubiquitin pathway

0 引言

泛素化是一種重要的轉(zhuǎn)錄后修飾方式[1]，控制著真核生物整個蛋白質(zhì)組。泛素途徑是由泛素激活酶（Ubiquitin-activating enzyme， E1）、泛素結(jié)合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme， E2）和泛素連接酶（Ubiquitin-protein ligase， E3）介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)[2]，是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑。E2是泛素途徑的關(guān)鍵酶，它與E1、E3通過蛋白間的相互作用使泛素與靶蛋白結(jié)合，形成一條多泛素鏈，從而使靶蛋白被26S蛋白酶體識別降解[3]。E2家族蛋白都有著相似的催化結(jié)構(gòu)域，這些催化結(jié)構(gòu)域都包含形成E2-泛素硫酯復(fù)合物的活性位點半胱氨酸（thioester-forming cysteine）。在對酵母的研究中，ubc-3（CDC34的同源基因）被證明是E2家族成員[4]，編碼Ⅲ類E2，負責(zé)細胞周期G1期的蛋白降解[5]。盡管已有研究表明E2在酵母等模式生物的細胞中起著重要作用[6]，但是目前國內(nèi)外對于植物寄生線蟲中這類分子的研究仍然非常有限。

在模式生物秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans）中，E2家族的UBC-18與UBC-3共同參與對同一底物的泛素化。UBC-18率先給底物標記一個泛素分子，隨后UBC-3負責(zé)在標記有一個泛素分子的底物上形成泛素鏈[1]。對秀麗線蟲相關(guān)基因的抑制或敲除均可引起秀麗線蟲不育或胚胎致死[7]。

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）是松材線蟲病的病原體[8]，是一種對東亞松林危害極大的入侵生物，現(xiàn)入侵中國、日本和韓國等東亞國家及歐州國家葡萄牙與西班牙[9]，對當?shù)厮闪稚鷳B(tài)造成了嚴重破壞，對林業(yè)經(jīng)濟造成了巨大損失。松材線蟲的胚胎發(fā)育和生命周期與秀麗線蟲非常相似[10]，因此假設(shè)泛素途徑蛋白有可能是開發(fā)殺線藥物的潛在靶點。

2011年公布的松材線蟲基因組數(shù)據(jù)[11]使得對松材線蟲泛素途徑的研究更加容易。本研究克隆到松材線蟲Bx-ubc-3基因，分析了可能參與控制Bx-UBC-3與泛素途徑其他組分相互作用的區(qū)域并推測其功能，分析了泛素途徑中關(guān)鍵要素Bx-UBC-3、E3和泛素形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。分析該途徑中的組分不僅有助于進一步理解其功能，建立一條理論的泛素通路，為后期的試驗打下理論基礎(chǔ)，還可以為今后的抗線蟲藥物的開發(fā)提供必要的思路。

1 材料與方法

1.1 線蟲培養(yǎng)、cDNA合成與轉(zhuǎn)錄組測序

試驗所用到的松材線蟲分離自中國廣東省患松材線蟲病的馬尾松（Pinus massoniana）。利用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢菌進行線蟲人工擴繁培養(yǎng)[12]。用M9緩沖液[13]洗脫松材線蟲懸浮液100 μl（混合蟲齡），用TRIzol試劑提取松材線蟲總RNA，并利用DNA酶降解基因組DNA后構(gòu)建cDNA文庫[14]。將上述cDNA文庫送華大基因生物公司測序。使用美國生物技術(shù)信息中心（NCBI）的在線BLASTN工具對測序結(jié)果進行鑒定。鑒定出ubc-3同源基因片段，命名為Bx-ubc-3。

1.2 基因克隆

用線蟲SL法（method of nematode spliced leader）[15]從松材線蟲的cDNA文庫中擴增了松材線蟲Bx-ubc-3基因序列的5端片段。在此基礎(chǔ)上，以SL1（GGT-TAT-ATC CAA GTT TGA G）和Ubc3-WH-2A（TCG AGA ACG TCC ACA TCA TC）為靶點，用oligo（dt）引物和以Ubc3-WH-1S為靶點的引物（GTT CGGA-ACA GTA GAGA GA）擴增3端片段。將純化的DNA片段克隆到pGEM-T載體（Promega，美國）中并測序。將5端和3端片段組裝成全長編碼序列，并提交給GenBank。

1.3 氨基酸序列及同源性分析

利用NCBI在線工具 ORF Finder進行ORF分析。用BLASTX/BLASTP進行核酸序列和氨基酸序列的同源性分析，E-value閾值為1×10-10。利用Clustal W進行多重序列比對，并用MEGA 5.05結(jié)合JTT+G模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（phylogenetic trees）[16]。使用上述ORF序列作為查詢序列在完整的松材線蟲基因組序列數(shù)據(jù)庫的TBLASTN搜索中發(fā)現(xiàn)了同源序列。

1.4 泛素途徑相關(guān)蛋白互作的建模與預(yù)測

提交FASTA格式的泛素途徑相關(guān)蛋白氨基酸序列至SWISS Model服務(wù)器進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模。輸出的模型通過定型模型能量分析（Qualitative Model Energy Analysis，QMEAN）賦值而著色，從而表示模型區(qū)域的準確度[17]。利用STRING 9.0預(yù)測泛素結(jié)合酶與其他蛋白之間可能的相互作用[18]。

1.5 泛素途徑相關(guān)蛋白對接與分子動力學(xué)模擬

為了定位分子對接位點，利用SWISS-PDB Viewer計算了蛋白質(zhì)的靜電表面電位，并繪制到分子表面。利用已經(jīng)公布的基因組數(shù)據(jù)[11]進一步確定Bx-UBC-3的配體。通過將Bx-UBC-3與Bx-泛素/Bx-Rbx1（Bx-ring-box1）對接，用HEX 6.3證實蛋白質(zhì)相互作用。

使用NAMD 2.9進行分子動力學(xué)的模擬。用VMD、PyMOl、BioEdit和POV-Ray等程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)進行了注釋說明。

2 結(jié)果與分析

2.1 松材線蟲Bx-ubc-3基因克隆

線蟲SL法產(chǎn)生的全長cDNA為957 bp。將這個cDNA序列命名為Bx-ubc-3，并提交給GenBank（GenBank ID：EU333281）。

基于松材線蟲基因組數(shù)據(jù)的TBLASTN同源性搜索發(fā)現(xiàn)CADV01004468.1與Bx-ubc-3所在contig（E-value：1×10-131）相關(guān)。

2.2 氨基酸序列及同源性分析

Bx-ubc-3的cDNA序列分析表明，其開放閱讀框（ORF）長度為783 bp，編碼245個氨基酸。將所鑒定的氨基酸序列與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進行比較，發(fā)現(xiàn)與所有已知的泛素結(jié)合酶具有同源性，其中與秀麗線蟲ubc-3同源性為94%（GenBank ID：NP_490882;E-value：3×10-86），與馬來絲蟲（Brugia malayi）ubc-3同源性為90%（GenBank ID：XPY9001894010，E-vlaue：3×10-91）。

Bx-UBC-3與人（Homo sapiens）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）和其他7種線蟲即非洲眼線蟲（Loa loa）、馬來絲蟲、豬蛔蟲（Ascaris suum）、秀麗線蟲、廣桿屬線蟲（C. briggsae）、C. brenneri和C. remanei的同源序列的多重比對表明，所有蛋白質(zhì)的基序同源（圖1（a））。UBC酶超家族的一般特征基序是HPN（組氨酸-脯氨酸-天冬酰胺）三肽和E2活性位點，即形成硫酯的Cys103（半胱氨酸）[19]。在上述所有物種的序列中都有發(fā)現(xiàn)上述所有特征基序和氨基酸殘基（圖1（a）方框），包括Pro（脯氨酸）和Trp（色氨酸）殘基（圖1（a） Pro134、Pro135和Trp176）、HPN三肽基序（圖1（a） His145-Pro146-Asn147）和保守的Cys155殘基（圖1（a））。

線蟲UBC-3 NJ樹（圖1（b））顯示了5個簇[20]。因為沒有發(fā)現(xiàn)其他的墊刃目（Tylenchida）UBC-3，松材線蟲是系統(tǒng)發(fā)育樹中唯一的植物線蟲。松材線蟲與尾目（Spirurida）、蛔蟲目（Ascaridida）和小桿目（Rhabditida）在遺傳距離上遠大于人和果蠅。這一結(jié)果也得到了另一個基于Bx-UBC-3和100個同源基因而構(gòu)建的NJ樹的證實。

2.3 Bx-UBC-3結(jié)構(gòu)分析

用SWISMOST服務(wù)器在線預(yù)測Bx-UBC-3蛋白結(jié)構(gòu)模型，進一步推測其功能。結(jié)果表明，Bx-UBC-3以β折疊為核心，兩側(cè)為4個α螺旋（H1-H4）、基本保守的310螺旋（h，殘基i和i+3之間有氫鍵）和兩個環(huán)（L1和L2）。L2是極性殘基Asp112（天冬氨酸）、Asp113、Gln115（谷氨酰胺）、 Gly117（甘氨酸）、Glu118和Glu122的酸性環(huán)。

人、果蠅和其他4種線蟲的同源序列同樣存在類似的結(jié)構(gòu)變異。當Bx-UBC-3在同系物上疊加時，顯示出高度保守的N端序列。盡管總體結(jié)構(gòu)相似，但這些蛋白在一些區(qū)域沒有顯著的構(gòu)象特征。

2.4 泛素途徑相關(guān)蛋白間互作預(yù)測

以人同源細胞分裂周期34（CDC34，E-value：1×10-80）為模板預(yù)測了與Bx-UBC-3可能存在功能關(guān)系的基因相互作用蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，Bx-UBC-3和SKP1-CUL1-F-box蛋白（SCF）E3之間存在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。7個蛋白與UBA-1的發(fā)生高度相關(guān)。這些蛋白中有3種是SCF相關(guān)蛋白：CUL1（cullin 1，the core component of multiple cullin-RING-based SCF）、RBX1（ring-box 1）和BTRC（β-transducin repeat， SCF的底物識別成分）。

2.5 泛素途徑相關(guān)蛋白Bx-UBC-3與SCF E3對接及結(jié)合位點分析

由于蛋白質(zhì)間相互作用預(yù)測表明Bx-UBC-3與SCF相關(guān)蛋白相互作用，基于全基因組數(shù)據(jù)分析[11]，發(fā)現(xiàn)了兩個與松材線蟲SCF相關(guān)的蛋白（Bx-Cul1和Bx-Rbx1）。基于已發(fā)表的X射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，將Bx-UBC-3與Bx-Cul1/Bx-Rbx1復(fù)合物對接，建立了完整的Bx-UBC-3、Bx-Cul1和Bx-Rbx1三元復(fù)合物的模型。

為了識別候選的對接位點，計算了Bx-UBC-3和Bx-Rbx1的靜電表面電位，并將其繪制到分子表面?；贐x-UBC-3、Bx-Cul1和Bx-Rbx1三元配合物和靜電表面，進一步預(yù)測Bx-UBC-3和Bx-Rbx1的相互作用。Bx-UBC-3位于Bx-Rbx1下方相對的靜電表面電勢裂隙上，在Bx-UBC-3上鑒定出帶正電荷的L2和帶負電荷的L1。

從Bx-UBC-3對接到Bx-Rbx1上，觀察到L1殘基Pro79和Tyr80（酪氨酸）可以與Bx-Rbx1結(jié)合（圖2（a2））。L2殘基Asn125和Pro126被埋入由Bx-Rbx1殘基Leu90（亮氨酸）和Ile38（異亮氨酸）形成的中心凹槽中（圖2（a1））?；贐x-UBC-3和Bx-RBX1的界面特征，分析了4個氫鍵間的相互作用（圖2（b1-b4））。Bx-UBC-3中常見的E3結(jié)合位點是Arg22（精氨酸）（H1）、Pro79（L1）、Tyr80（L1）、Ala120（丙氨酸）（L2）和Cys121（L2）。

2.6 泛素途徑相關(guān)蛋白Bx-UBC-3與泛素對接及結(jié)合位點分析

松材線蟲Bx-泛素基于全基因組數(shù)據(jù)鑒定。通過E2-泛素復(fù)合物結(jié)構(gòu)比對，鑒定得到Bx-UBC-3與松材線蟲泛素復(fù)合物模型。在Bx-UCB-3與Bx-泛素復(fù)合體中結(jié)合位點中，Bx-UBC-的催化裂隙處中心是Bx-泛素的殘基Arg42和Gly76，Bx-UBC-3淺裂處的一側(cè)是殘基Ser139（絲氨酸）和Glu143，另一側(cè)是殘基Cys103。

模擬對接數(shù)據(jù)說明Bx-UBC-3和Bx-泛素通過硫酯模型相互作用。在Bx-UBC-3和Bx-泛素蛋白上發(fā)現(xiàn)了互補表面結(jié)構(gòu)，Bx-泛素蛋白C端圍繞Bx-UBC-3蛋白，終止于Cys103（Bx-UBC-3）和Gly76（Bx-泛素）（圖3（a2））。形成硫酯的Cys103位于連接S4和H的相對非結(jié)構(gòu)化區(qū)域（L2）上。

2.7 泛素途徑相關(guān)蛋白分子動力學(xué)模擬

通過分子動力學(xué)模擬研究了Bx-UBC-3的動態(tài)性能。同時計算了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的催化裂痕的柔度曲線和相關(guān)性（圖4）。繪制了Bx-UBC-3級聯(lián)軌跡的仿真幀（圖4（a）），并根據(jù)每個殘基的均方根偏差（root mea square deviation，RMSD）著色（圖4（b））。結(jié)合位點的RMSD值用紅星標記（圖4（d））。在酸性環(huán)L2中除了Ala120和Cys121外，大多數(shù)結(jié)合位點在平衡過程中表現(xiàn)出較少的運動。低RMSD值表明了模型的質(zhì)量符合要求并可用于對接模擬。

分子動力學(xué)模擬證實，酸性環(huán)L2在Bx-UBC-3中具有最高的構(gòu)象自由度。L2環(huán)與E2活性位點（形成硫酯的Cys103）緊密相連，其酸性插入特征是高構(gòu)象變異（圖4（a）和圖4（c）），這可以用RMSD定量描述（圖4（d））。這些結(jié)果與其他E2 X射線晶體學(xué)的結(jié)果一致[21]。

蛋白質(zhì)泛素化[22]過程中，E2的磷酸化是由蛋白激酶2介導(dǎo)的，酪蛋白激酶2依賴于保守Ser和酸性殘基之間的靜電排斥[23]。在動力學(xué)模擬中，L2中的酸性極性殘留物瞬間接近催化裂隙（從28.2到10.3 ）（圖4（c））和Ser139所在的H2。這一結(jié)果表明，引入強負電荷基團的Ser139磷酸化可能導(dǎo)致與上述酸性殘基的靜電排斥，從而有利于L2開放構(gòu)象。此外，L2在與Bx-RBX1對接（圖4（c））時呈現(xiàn)拓撲扭曲（32.7 ）。這些結(jié)果表明，L2具有較高的構(gòu)象自由度，證實了L2在這種相互作用中起著關(guān)鍵作用。

3 討論與結(jié)論

在過去的數(shù)十年中，不斷有新的泛素化酶及其參與的生理過程被發(fā)現(xiàn)[24]。現(xiàn)有的研究方法多數(shù)以蛋白降解過程為切入點，即目的蛋白通過泛素途徑被蛋白酶體降解的過程。誘導(dǎo)降解更直接的方法是將目的蛋白直接與蛋白質(zhì)降解酶靶向連接。E2靶標的識別可通過E2生物酶工程還原，即在非細胞的體外條件下，將含有合適蛋白結(jié)合肽的E2融合到靶蛋白C末端[25]。這種蛋白質(zhì)間的相互作用將降解酶與目標蛋白非共價結(jié)合的策略應(yīng)用于蛋白酶體介導(dǎo)的降解過程。本試驗克隆了松材線蟲Bx-ubc-3基因，研究了該基因編碼的泛素結(jié)合酶Bx-UBC-3的晶體結(jié)構(gòu)，模擬了相關(guān)蛋白的相互作用，基于這些研究，發(fā)現(xiàn)了一個理論泛素通路。本研究獲得的信息將有助于今后Bx-UBC-3的功能研究、工程化蛋白的開發(fā)利用，以及開發(fā)用于植物保護的Bx-UBC-3功能控制技術(shù)。對松材線蟲中泛素依賴途徑調(diào)控的蛋白質(zhì)降解選擇性靶向性的進一步認識，也將為植物線蟲的有效防治提供新的思路。

本試驗克隆了松材線蟲的一種泛素結(jié)合酶（E2）基因Bx-ubc-3，并對其功能進行了研究。研究鑒定了Bx-UBC-3和Bx-泛素之間的相互作用。其結(jié)構(gòu)研究表明了Bx-UBC-3與其配體的互作機理，說明了Bx-UBC-3是開發(fā)有效的松材線蟲藥物的一個潛在靶標，為Bx-UBC-3抑制劑的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，同時也為松材線蟲的防治工作提供了新的思路。

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