基于PCR技術(shù)的香栓菌和毛栓菌快速檢測

陳鑫源 戚大偉 孫婧

摘 要：木材腐朽在多數(shù)的情況下是由對木材具有腐蝕能力的相關(guān)真菌的生長繁殖所造成的。為了鑒定造成木材腐蝕的菌種，本文首先從腐朽的木材上分離獲得木材腐朽菌，對其進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行形態(tài)學(xué)的初步鑒定，再通過分子生物學(xué)領(lǐng)域PCR法對其進(jìn)行有效性鑒定。分別采用蝸牛酶法、CTAB法、SDS法和蛋白酶K對木材腐朽真菌的全基因進(jìn)行提取，且對提取的DNA進(jìn)行紫外吸收光譜和瓊脂糖凝膠電泳（AGE）檢測， 然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最后對其進(jìn)行綜合的比對分析得知：木材腐朽真菌1為香栓菌， 2為毛栓菌。

關(guān)鍵詞：木材腐朽菌;分離培養(yǎng) ;PCR;分子生物學(xué)鑒定;形態(tài)學(xué)鑒定

中圖分類號：S782.33 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? 文章編號：1006-8023（2019）05-0063-05

Abstract：In most cases， wood decay is caused by the growth and reproduction of related fungi that have the ability to corrode the wood itself. To identify the species that caused the wood corrosion， in this paper， wood decay fungi were firstly isolated from decaying wood， cultured and morphologically identified， and then identified by PCR in the field of molecular biology. The whole genes of wood decay fungi were extracted by using snail enzyme method， CTAB method， SDS method， and proteinase K respectively， and the extracted DNA was subjected to ultraviolet absorption spectrum and agarose gel electrophoresis （AGE） detection. Then PCR amplification along with sequencing was processed and a phylogenetic tree was constructed. At last， a comprehensive comparative analysis was made， and the results were： the decaying wood fungi 1 was Trametes suavelones and decaying wood fungi 2 was Trametes hirstuta.

Keywords：Wood decay fungi; isolation and culture; PCR; molecular biological identification; morphological identification

0 引言

木材是我國全部資源中蘊(yùn)含能量最大的資源品種之一。木材腐朽是木材本身的細(xì)胞壁在真菌的作用下逐漸發(fā)生分解，進(jìn)而導(dǎo)致其出現(xiàn)糟爛或者解體，主要是由能夠?qū)δ静倪M(jìn)行入侵腐蝕的真菌的生長代謝造成的[1]。真菌類微生物對木材的侵蝕，會(huì)大量的浪費(fèi)地球上的樹木資源，也會(huì)導(dǎo)致相關(guān)菌類大量繁殖，造成短期內(nèi)相對環(huán)境的微生物群發(fā)生改變，進(jìn)而造成該區(qū)域的物種平衡受到嚴(yán)重破壞[1]。本文對木材腐朽菌的基因組進(jìn)行提取，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得序列與Genbank上的全部數(shù)據(jù)信息開展BLAST比對以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察鑒別出造成木材腐朽的菌種[2-3]。

1 材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

本實(shí)驗(yàn)的菌株子實(shí)體從大興安嶺自然保護(hù)區(qū)柳樹的活立木材上采集。用酒精棉將刀具擦拭后進(jìn)行切割，將采集來的菌株放在無菌袋內(nèi)保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)主要采用PDA培養(yǎng)基：將馬鈴薯取200 g去皮處理切片狀，煮置的沸液用紗布進(jìn)行過濾處理，向其中加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉，用蒸餾水定容至1 000 ml，pH為7.0，121℃滅菌20 min[4-5]。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)儀器為儀臺式離心機(jī)、精密天平、紫外分光光度計(jì)、漩渦震蕩器、小型高速離心機(jī)、組合式搖床、高壓蒸汽滅菌鍋及PCR儀等。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)試劑為山梨醇、SDS、CTAB、醋酸鉀、氯仿、蝸牛酶、蛋白酶K、EDTA瓊脂糖和TaqDNA聚合酶，這些購自上海綠葉生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1篩選方法

本實(shí)驗(yàn)將采集的子實(shí)體進(jìn)行處理，置消毒溶液中處理2～5 min[6-7]。用無菌蒸餾水多次洗滌，用無菌的鑷子將組織塊取少許轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長出來后進(jìn)一步分離，置-80 ℃冰箱保藏[8]。

1.2.2 培養(yǎng)方法

從-80 ℃的冰箱里取出保藏的菌株進(jìn)行活化處理，首先將其接種到馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化，培養(yǎng)7 d，再將培養(yǎng)完的菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上。記錄每組菌落生長情況，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 木材腐朽真菌的分離純化

將培養(yǎng)好的真菌置入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行生長。選擇長勢比較明顯的菌落進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，放入25 ℃的搖床中培養(yǎng)。7 d后選擇單菌落進(jìn)行密集劃線純化培養(yǎng)，獲得兩株純的木材腐朽真菌，將其進(jìn)行冰箱4 ℃保藏[9]。

由于木材腐朽真菌能夠分解纖維素酶，因此將分離獲得的純木材腐朽真菌轉(zhuǎn)接至PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基中，25 ℃下培養(yǎng)一周，觀察菌落生長情況、變色圈是否出現(xiàn)以及菌絲的顏色變化[10-11]。

1.2.4 木材腐朽真菌的基本形態(tài)觀察分析

對實(shí)驗(yàn)采集的新鮮的木材腐朽真菌子實(shí)體及組織等進(jìn)行宏觀環(huán)境下觀察（圖1和圖2）。對其生長良好的菌絲進(jìn)行顯微鏡觀察，在具體的微觀環(huán)境下進(jìn)行特征觀察（圖3和圖4）。

1.2.5 基因組的提取及DNA純度分析與對比

分別采取蝸牛酶法、CTAB法、SDS法、蛋白酶K法對兩種木材腐朽菌進(jìn)行DNA的提?。?種方法原理過程均為離心洗滌取沉淀物，不一一詳細(xì)描述），并選取瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)兩種方法對其純度進(jìn)行檢測。

1.2.6 PCR擴(kuò)增與擴(kuò)增情況分析

提取的DNA用于下列PCR實(shí)驗(yàn)：dNTP，緩沖液，Mg2+，模板1 μl，緩沖液2 μl，dNTP 2 ul，Taq酶1 ul，每種引物0.5 μl，補(bǔ)充無菌水至足量。反應(yīng)的條件：預(yù)變性和變性的條件為94 ℃，退火55 ℃，延伸和補(bǔ)平72 ℃，循環(huán)次數(shù)35次[12-14]，進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，對擴(kuò)增后獲得的目的條帶再次進(jìn)行跑膠驗(yàn)證，電泳觀察擴(kuò)增出來的條帶長度是否正確。將其回收純化，將純化后的產(chǎn)物進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

子實(shí)體觀察：菌1子實(shí)體中等，木栓質(zhì)，無柄。菌蓋半圓形，墊狀，新鮮時(shí)軟木栓質(zhì)，干時(shí)堅(jiān)硬，厚2 cm，白色至淺灰色或淺黃白色無明顯的同心環(huán)帶和輪紋，邊緣鈍。管口白色或灰色，圓形至近多角形，孢子長橢圓形或短圓柱形，平滑;菌2子實(shí)體小，無柄，木栓質(zhì)。菌蓋厚2.5 cm左右，半圓形，平近薄片狀，黃白色粗毛束，有同心環(huán)帶，邊緣較薄而銳。菌肉白色，菌管一層，與菌肉同色同質(zhì)，管孔較大，圓形或廣橢圓形，彎曲不整。

菌落培養(yǎng)觀察：通過對木材腐朽真菌的子實(shí)體進(jìn)行采集和組織塊的切取，對其進(jìn)行消毒處理，利用劃線操作法，分離及純化獲得品質(zhì)較純的真菌，對其挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)兩周后，發(fā)現(xiàn)兩種菌的菌落生長情況比較相似，其表面四周為白色，培養(yǎng)時(shí)間越長，菌落的顏色漸變?yōu)楹稚鷽]有明顯味道。生長速度較快，表面呈現(xiàn)絨毛狀，疏松的排列在培養(yǎng)基表面，形成一個(gè)絨毛狀菌落。成熟時(shí)為黃褐色。

顯微鏡觀察：通過菌落生長完成后挑取少量菌絲進(jìn)行顯微鏡檢測，在顯微鏡觀察下，菌絲沒有任何顏色，出現(xiàn)囊狀豬，含有形似卵狀的孢子，透明光滑，主要觀測的結(jié)果如圖3和圖4所示。細(xì)胞壁比較厚重，無明顯分生孢子，有很多纖維形狀的菌絲狀態(tài)。

經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定，初步判斷真菌1屬于非褶菌目，多孔菌科，和栓菌屬。真菌2屬多孔菌目，多孔菌科，擔(dān)子菌綱。形態(tài)學(xué)觀察無法達(dá)到種的鑒定。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

（1）瓊脂糖凝膠電泳檢測：蛋白酶K法提取DNA法較蝸牛酶法、CTAB法和SDS法電泳條帶更完整，沒有明顯的拖尾現(xiàn)象。其中，蝸牛酶提的DNA條帶不夠清晰，CTAB法提取的DNA濃度較小，含有一定量的雜質(zhì);而且利用SDS法進(jìn)行提取獲得的基因組DNA在電泳圖中能夠看出具有非常明顯的降解現(xiàn)象（圖5和圖6）[15-16]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采取不同方法對木材腐朽真菌的基因組進(jìn)行提取，對提取獲得的DNA利用紫外吸收光譜和瓊脂糖凝膠電泳（AGE）檢測。進(jìn)行目的條帶的PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收及測序，進(jìn)行相關(guān)序列比對，結(jié)合形態(tài)生物學(xué)手段，獲知木腐菌1為香栓菌，木腐菌2為毛栓菌。傳統(tǒng)方法所需的實(shí)驗(yàn)周期長，存在的干擾因素多，且不同的人對同一物質(zhì)的描述可能存在差異，無法達(dá)到種的鑒定。所以需要通過基因分子技術(shù)對菌種進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。但是，序列比對的過程中，因基因庫不全面，可能導(dǎo)致相關(guān)的序列無法被檢測出來，所以在分子鑒定的過程中仍存在問題。

【參 考 文 獻(xiàn)】

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