祭仲石 朱建樓 韋 艷 王中清 厲成新

鯽魚腦孢子學(xué)名洪湖碘泡蟲，感染了洪湖碘泡蟲的鯽魚在咽喉部形成孢囊，孢囊內(nèi)存在大量孢子，隨著孢子蟲的繁殖，孢囊擴(kuò)大，咽喉部腫大，堵塞咽喉造成鯽魚吃食不便、體型消瘦、眼球突出、鰓蓋外張無法閉合。該病一般在每年6月中旬開始暴發(fā)，最長可持續(xù)到11月，廣泛流行于江蘇、湖北、湖南等地區(qū)，死亡率高達(dá)80%。不幸的是，到目前為止，對(duì)洪湖碘泡蟲的生活史、感染途徑等還不清楚，缺乏相關(guān)基礎(chǔ)研究，且洪湖碘泡蟲在鯽魚體內(nèi)形成成熟的孢子后，外面會(huì)形成堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)外殼，一般的藥物很難進(jìn)入，無法達(dá)到良好的治療效果，因此，對(duì)鯽魚腦孢子蟲的重點(diǎn)工作在于早期預(yù)防。

目前檢測腦孢子蟲主要以顯微鏡或者肉眼觀察發(fā)病部位判斷孢子蟲發(fā)病情況，檢測結(jié)果因人而異，準(zhǔn)確性低，時(shí)效性差，傳統(tǒng)方法難以有效診斷處于易于治療的營養(yǎng)體時(shí)期。因此我們使用分子生物學(xué)方法，探索分子檢測方法在鯽魚腦孢子蟲的早期檢測中的可行性，為鯽魚養(yǎng)殖過程中腦孢子蟲的早期防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

各種孢子蟲樣品和實(shí)驗(yàn)魚樣品于2019年6月取自江蘇大豐某鯽魚養(yǎng)殖塘口，基因組DNA提取試劑盒、PCRMix采購自天根生化科技有限公司；溴化乙錠（EB）等購自北京艾德萊；擴(kuò)增引物由上海生工合成。

1.2 腦孢子蟲基因組的提取

在實(shí)驗(yàn)室中，取6尾發(fā)病鯽魚，將咽喉部孢囊剪開，取100mg左右孢子蟲樣品，加100μL的0.7%生理鹽水稀釋后用細(xì)胞破碎器研磨成糊狀，再用基因組DNA 提取試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作提取總基因組，基因組置于冰箱( -20 ℃) 中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因組DNA的PCR擴(kuò)增

采用洪湖碘泡蟲特異引物擴(kuò)增樣腦孢子蟲基因組，引物序列如表1 所示。PCR 反應(yīng)體系( 20μL) ： 10μL 2×Taq PC R MasterMix ，2μL 引物(MhF 1 μL、MhR 1 μL) ，1 μL DNA，7μLddH2O。PCR 反應(yīng)程序： 95℃下預(yù)變性5 分鐘; 94℃下變性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸30秒，共進(jìn)行32 個(gè)循環(huán); 最后在72℃下延伸10分鐘，于4℃下保溫30分鐘。PCR 產(chǎn)物用添加溴化乙錠（EB）的1% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

表1 引物序列

1.4 臨床樣品檢測

于2019年6月在江蘇大豐某鯽魚養(yǎng)殖塘口料臺(tái)使用旋網(wǎng)取10尾鯽魚，在顯微鏡下觀察無明顯孢子蟲癥狀，然后根據(jù)分子檢測方法進(jìn)行鯽魚腦孢子蟲的分子檢測。

2 結(jié)果分析

2.1 患病鯽魚臨床癥狀

患病鯽魚如圖1，感染了洪湖碘泡蟲的鯽魚在咽喉部形成孢囊，孢囊內(nèi)存在大量孢子蟲，隨著孢子蟲的繁殖，孢囊擴(kuò)大，咽喉部腫大充血，堵塞咽喉造成鯽魚吃食不便、體型消瘦、眼球突出、鰓蓋外張無法閉合。剪開咽喉部，可見大量白色豆腐渣狀孢囊，顯微鏡下觀察，成熟的腦孢子蟲呈瓜子狀，前尖后圓，孢子前段具有兩個(gè)極囊。

2.2 腦孢子蟲基因組PCR結(jié)果

鯽魚腦孢子蟲基因組的PCR電泳圖譜如圖2，其中1-6號(hào)為腦孢子蟲實(shí)驗(yàn)樣品，7號(hào)使用ddH2O為模板作為陰性對(duì)照。電泳結(jié)果顯示，1-6號(hào)樣品在479bp左右有亮帶，陰性對(duì)照沒有出現(xiàn)條帶，與預(yù)期結(jié)果相同，說明該方法可以用于鯽魚腦孢子蟲的檢測。

2.3 臨床樣品檢測結(jié)果

圖3結(jié)果顯示，顯微鏡檢查沒有孢子蟲感染的鯽魚，通過分子檢測方法，10尾樣品中共檢出四4尾感染孢子蟲。說明在傳統(tǒng)檢測方法無法檢測處于感染腦孢子早期的鯽魚，分子檢測方法在鯽魚腦孢子的臨床檢測中檢出率高，實(shí)用性強(qiáng)，在生產(chǎn)中有一定的利用價(jià)值。

圖3 鯽魚樣品PCR圖譜

圖1 鯽魚感染腦孢子蟲癥狀

圖2 腦孢子蟲基因組凝膠電泳圖譜

3 討論

近年來鯽魚“腦孢子蟲病”來勢猛、傳播快、死亡率高，給養(yǎng)殖戶造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失，是威脅鯽魚養(yǎng)殖最嚴(yán)重的寄生蟲病害。而及時(shí)發(fā)現(xiàn)病情，及時(shí)治療是關(guān)鍵。在鯽魚腦孢子蟲檢測中，傳統(tǒng)方法的主觀性較強(qiáng)，對(duì)結(jié)果的誤判較高，大量的研究表明腦孢子蟲的分子檢測比傳統(tǒng)的顯微鏡檢查靈敏度高。

腦孢子在感染早期，鯽魚沒有明顯感染癥狀，一般到每年的6月中旬才開始大規(guī)模發(fā)病，因而難以發(fā)現(xiàn)，難以及時(shí)用藥物進(jìn)行防治。本文結(jié)果說明鯽魚感染早期還未大規(guī)模暴發(fā)時(shí)就可以檢測出，因此可以在鯽魚沒有大規(guī)模感染的時(shí)候，通過定期分子檢測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)是否存在腦孢子蟲感染。在鯽魚感染腦孢子早期檢測出來，及時(shí)投喂鹽酸氯苯胍、地克珠利、檳榔散等藥物進(jìn)行驅(qū)蟲，同時(shí)使用環(huán)烷酸銅、敵百蟲等藥物進(jìn)行水體殺蟲，將腦孢子控制在發(fā)病前期，減少大規(guī)模暴發(fā)帶來的損失。同時(shí)，該方法還可以用于鯽魚魚種的檢測，在采購鯽魚魚種時(shí)，對(duì)魚種進(jìn)行腦孢子蟲的分子檢測，確認(rèn)魚種是否攜帶腦孢子蟲，擇優(yōu)選擇魚種，保障養(yǎng)殖安全。與傳統(tǒng)顯微鏡檢測手段相比，分子檢測方法大大提高了疾病的檢出成功率。既解決了魚種階段難以有效判斷疾病的難題，更為成魚養(yǎng)殖過程中精準(zhǔn)用藥提供了寶貴數(shù)據(jù)支撐。