付玉冰 董愛英,* 汪亞斯 張嫘 黃軍祉 周海健

(1 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，唐山 063000；2 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206)

肺炎克雷伯菌是臨床常見的醫(yī)院感染條件致病菌，可導(dǎo)致肺炎、敗血癥、肝膿腫等多種感染[1]。隨著碳青霉烯類藥物越來越廣泛的應(yīng)用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenemresistantKlebsiella pneumoniae, CRKP)呈逐年上升趨勢，使抗生素選擇性壓力愈加嚴(yán)重，增加了患者的治療難度且死亡率較高。近年來，國內(nèi)外對新出現(xiàn)的高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiella pneumoniae,hvKP)的研究報道有很多，而對于hvKP菌血癥的相關(guān)報道卻并不多見。由于我院近期CRKP血流感染死亡率的大幅提升，給臨床工作帶來了很大的困擾，因此本研究旨在了解我院CRKP血流感染患者的臨床特征，分析CRKP高毒力血清型的分布情況，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

連續(xù)收集我院2016年11月—2017年9月臨床血培養(yǎng)標(biāo)本中分離出的肺炎克雷伯菌，篩選出CRKP 22株(同一患者分離的相同菌株不重復(fù)記錄)。

1.1.2 主要儀器和試劑

Phonenix-100全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)及配套試劑由美國BD公司生產(chǎn)；PCR擴(kuò)增儀由德國Eppendorf公司生產(chǎn)；電泳儀由美國BioRad公司生產(chǎn)；PCR試劑由上海生物工程有限公司生產(chǎn)；培養(yǎng)基和替加環(huán)素MIC測試條由溫州康泰生物科技有限公司生產(chǎn)；藥敏紙片由英國Oxoid公司生產(chǎn)。

1.1.3 質(zhì)控菌株

大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853和金黃色葡萄球菌ATCC25923為藥敏質(zhì)控菌株；肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705為改良Hodge試驗陽性對照菌株、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706為改良Hodge試驗陰性對照菌株。質(zhì)控菌株均購自溫州市康泰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏試驗

采用美國BD公司生產(chǎn)的Phonenix-100全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)、聯(lián)合紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行菌株鑒定和藥敏試驗。替加環(huán)素藥敏試驗方法為E-test法。藥敏結(jié)果判讀參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究協(xié)會(CLSI)M100-S26文件2017年推出的判讀標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.2.2 表型檢測

采用改良Hodge試驗篩查碳青霉烯酶表型，EDTA協(xié)同試驗篩查金屬β-內(nèi)酰胺酶。

1.2.3 PCR檢測khe基因、耐藥基因及血清型

煮沸法制備DNA模版，采用PCR方法擴(kuò)增肺炎克雷伯菌的體外溶血酵素基因khe，2種常見耐藥基因(blaKPC、blaIMP)和6種高毒力血清型(K1、K2、K5、K20、K54和K57)。PCR引物見表1，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見參考文獻(xiàn)[3-4]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)基因測序后與GenBank基因庫中的已知序列進(jìn)行Blast比對。

2 結(jié)果

2.1 表型確認(rèn)試驗

改良Hodge試驗結(jié)果顯示，22株CRKP均為陽性，陽性率為100.0%。

2.2 khe基因檢測

用PCR方法篩選肺炎克雷伯菌體外溶血酵素基因(khe)，結(jié)果均為陽性。圖1表明血培養(yǎng)標(biāo)本分離到的菌株均為肺炎克雷伯菌。khe擴(kuò)增條帶大小為428bp，與理論值相符。

2.3 耐藥基因檢測

PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2，22株CRKP中有17株攜帶blaKPC基因，檢出率為77.3%，未檢出blaIMP基因。

2.4 高毒力血清型檢測

2.4.1 PCR基因擴(kuò)增及序列對比

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，通過凝膠成像儀可見待測菌株的目的基因條帶，結(jié)果見圖3。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)基因測序后與GenBank基因庫中的已知序列進(jìn)行Blast比對。

2.4.2 高毒力血清型檢出情況

22株CRKP有5株檢出高毒力血清型，檢出率為22.7%。其中K1型1株，占4.5%；K5型2株，占9.1%；K20型2株，占9.1%。

表1 細(xì)菌PCR靶標(biāo)與引物Tab.1 Primers used in this study

圖1 臨床肺炎克雷伯菌khe基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification of khe gene

圖2 耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification of drug resistant gene

2.4.3 高毒力CRKP菌株分布及臨床特點

圖3 高毒力血清型PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Results of PCR amplification of hypervirulent serotypes

我院2016年11月—2017年9月共檢出血流感染CRKP22例，其中有5例存活，17例死亡，死亡率達(dá)77.3%?；颊咂骄挲g為66歲，平均住院時間為28d，有導(dǎo)管留置或使用呼吸機(jī)的患者占59.1%。患者多有較重的心腦血管疾病或呼吸系統(tǒng)疾病等，科室分布主要在重癥醫(yī)學(xué)科(59.1%)，神經(jīng)內(nèi)科重癥病房(22.7%)，泌尿外科(9.1%)，血液科(4.5%)等。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，22株CRKP有5株檢出高毒力血清型，并且主要分布在不攜帶blaKPC基因的菌株中，其中K1型1株，為不產(chǎn)KPC菌株；K5型2株，均為不產(chǎn)KPC菌株；K20型2株，有一株為不產(chǎn)KPC菌株。檢出高毒力CRKP菌株的患者死亡率為80.0%。具體情況見表2。

2.4.4 CRKP菌株毒力與耐藥情況

將5株毒力菌株與17株非毒力菌株的藥敏結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。22株CRKP對亞胺培南和美羅培南的耐藥率為100%，對替加環(huán)素和多黏菌素完全敏感，毒力菌株與非毒力菌株對復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率差別不大，分別為60.0%和52.9%，但對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率差別較大，表現(xiàn)為毒力菌株對氨基糖苷類抗生素的耐藥率更低。

表2 高毒力CRKP菌株分布及臨床特點Tab.2 The distribution of hypervirulent serotype and clinical characteristics of CRKP

表3 CRKP菌株毒力與耐藥情況Tab.3 The hypervirulent serotypes andresistance of CRKP

3 討論

目前，CRKP引起的血流感染已經(jīng)較為常見，并且主要是醫(yī)院獲得性感染，特別是在重癥監(jiān)護(hù)病房，因患者病情危重，免疫力低下，一旦發(fā)生導(dǎo)管留置易引起導(dǎo)管相關(guān)血流感染，治療困難且死亡率較高[5]。在本次研究中，CRKP患者的病區(qū)主要分布在重癥醫(yī)學(xué)科(59.1%)，神經(jīng)內(nèi)科重癥病房(22.7%)，泌尿外科(9.1%)，血液科(4.5%)等，患者年齡偏大，住院時間較長，有心腦血管疾病或呼吸系統(tǒng)疾病等。在22例CRKP血流感染的患者中，有5例存活，17例死亡，死亡率達(dá)77.3%，死亡的患者大多采用了中心靜脈導(dǎo)管、呼吸機(jī)等有創(chuàng)操作。由美國CDC2013年公布的數(shù)據(jù)顯示，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌引起的血流感染死亡率達(dá)50.0%，約6.5%的患者死于CRKP[6]，由此可見我院CRKP血流感染的死亡率較高，是威脅患者生命的重要危險因素。

khe基因僅存在于肺炎克雷伯菌中，編碼大小為19kDa的蛋白，可能有溶血素活性，因此可作為鑒定肺炎克雷伯菌的特異性靶標(biāo)[7]。本研究中的22株肺炎克雷伯菌的khe基因PCR檢測結(jié)果均為陽性，再次證實了khe基因作為肺炎克雷伯菌標(biāo)示序列的可靠性。

20世紀(jì)80年代，臺灣學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌性肝膿腫，并提出了hvKP[8]。hvKP毒力的增加主要與莢膜多糖、鐵攝取系統(tǒng)及毒力基因有關(guān)，其中莢膜多糖是肺炎克雷伯菌的重要毒力因子，可有效介導(dǎo)菌體逃避或抵抗宿主的免疫殺傷和保護(hù)細(xì)菌免受中性粒細(xì)胞的吞噬[9]。根據(jù)莢膜多糖(K抗原)分型，可將肺炎克雷伯菌分為82個K血清型，其中K1、K2、K5、K20、K54和K57血清型與人和動物各種侵襲性感染密切相關(guān)，被認(rèn)定為高毒力血清型肺炎克雷伯菌。根據(jù)文獻(xiàn)報道[10]，wzy_K1、wzy_K2、wzx_K5、wzy_K20、wzx_K54和wzx_K57分別為這6種高毒力血清型的特異性靶基因，因此，本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]合成了相應(yīng)的引物，利用PCR的方法進(jìn)行血清型鑒定。結(jié)果顯示22株CRKP有5株檢出高毒力血清型，檢出率為22.7%，其中K1型1株(占4.5%)，K5型2株(占9.1%)，K20型2株(占9.1%)，與吳華等[12]報道不相符，其中K1和K2血清型的比例較少，經(jīng)分析可能與本研究標(biāo)本量較少或地區(qū)差異有關(guān)。

Jung等[13]提出細(xì)菌為了獲得耐藥基因以取得最佳適應(yīng)而丟棄一些毒力因子，因此本研究也關(guān)注了細(xì)菌毒力與耐藥基因之間的關(guān)系。依據(jù)楊麗君等[14]報道，blaKPC和blaIMP為本地區(qū)最主要的耐藥基因，因此在本次試驗之前已經(jīng)對這兩種耐藥基因進(jìn)行篩查，結(jié)果有17株CRKP檢出blaKPC基因，未檢出blaIMP基因。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)高毒力CRKP主要分布在不攜帶耐藥基因的菌株中，并且有90.0%以上的非毒力菌株攜帶耐藥基因，說明致病力較高的CRKP可能對藥物的敏感度更高。另外本試驗分離到1株產(chǎn)KPC酶基因的K20菌株，這與張嶸等[15-16]試驗結(jié)果一致，說明越來越多的研究在CRKP菌株中檢出產(chǎn)KPC的高毒力菌株。

毒力菌株與非毒力菌株的藥敏結(jié)果顯示，22株CRKP對碳青霉烯類抗生素的耐藥率為100%，對替加環(huán)素和多黏菌素完全敏感，毒力菌株與非毒力菌株對復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率差別不大，分別為60.0%和52.9%，但對氨基糖苷類抗生素的耐藥率差別較大，表現(xiàn)為毒力菌株對氨基糖苷類抗生素更敏感，這與程穎等[17]研究發(fā)現(xiàn)的hvKP藥物敏感率大于經(jīng)典肺炎克雷伯菌的說法一致，為兩者所引起血流感染的臨床用藥及預(yù)后差別提供了實驗室依據(jù)。

由此可見，我院血流感染CRKP菌株存在高毒力血清型，提示臨床醫(yī)生應(yīng)提高對hvKP的注意，重視血流感染的診治與控制，為患者提供良好的就醫(yī)環(huán)境。本次研究的標(biāo)本量較少，使試驗結(jié)果存有一定的局限性，因此，本研究下一步計劃探究碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌與CRKP的毒力差異、呼吸道感染與血流感染CRKP的毒力差異，從而更加有針對性地防控和治療CRKP引起的相關(guān)感染。