吳秀萍 耿榮華 曲芬 郭玲玲 楊鐵英

(航空總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100012)

近年來(lái)，隨著臨床上大量使用廣譜抗菌藥物、腫瘤化療藥、激素、免疫抑制劑等，臨床上念珠菌感染病例越來(lái)越多，嚴(yán)重威脅了患者的生命健康[1]。在抗真菌藥物的使用過(guò)程中，以唑類藥物應(yīng)用最多，尤其是氟康唑的應(yīng)用最為廣泛[2]，但由于其長(zhǎng)期大量的使用，藥物的副作用和耐藥問(wèn)題成為臨床上治療假絲酵母屬感染棘手的問(wèn)題。大蒜素是大蒜的球莖中提取的揮發(fā)性油狀物質(zhì)，具有廣譜的抗微生物活性，且生物性能好、毒副作用小、臨床已廣泛用于抗感染治療[3]。針對(duì)以上問(wèn)題，為臨床上尋找更好的抗真菌治療方法，聯(lián)合應(yīng)用不同藥理作用機(jī)制的抗菌藥物，為減少其副作用及耐藥性的研究正在展開。本研究評(píng)價(jià)氟康唑和大蒜素聯(lián)合抗假絲酵母的體外活性，以期為臨床抗假絲酵母的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

65株假絲酵母來(lái)自于航空總醫(yī)院微生物室2015—2018年的臨床送檢標(biāo)本，包括白色假絲酵母(Candida albicans)51株、光滑假絲酵母(Candida glabratas)8株、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)6株、其中耐氟康唑的假絲酵母有10株。質(zhì)控菌株選用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(clinical and laboratory standards institute, CLSI)推薦的白色假絲酵母標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC90029。

1.2 抗菌藥物

大蒜素(garlicin)，規(guī)格：20mg，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：110B023；氟康唑(Fluconazole),規(guī)格：1g，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：504B031。

1.3 儀器與試劑

VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀，酶標(biāo)儀：Sunrise；酵母樣真菌鑒定卡、酵母樣真菌藥敏卡(微量稀釋法)購(gòu)于法國(guó)Bio-Merieux公司；沙保羅瓊脂培養(yǎng)粉：購(gòu)自杭州濱和有限公司；RPMI1640和小牛血清購(gòu)自賽默飛世爾儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌液的配置

將待測(cè)菌從-80℃冰箱中取出，室溫下融化。然后接種于沙堡羅瓊脂培養(yǎng)基35℃下孵育24h，取單一的菌落再次轉(zhuǎn)接種于沙保羅瓊脂培養(yǎng)基中35℃孵育24h，以確保純種和活力，挑取菌落置于3mL 0.85%的生理鹽水中，利用牛鮑氏計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)真菌數(shù)量，再用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，最終濃度約為2.0×103CFU/mL。

1.4.2 藥液的配置

氟康唑原粉用無(wú)菌蒸餾水，配制其濃度為1280μg/mL，貯存液分裝至無(wú)菌的聚丙烯小管內(nèi)，于-80℃冰箱中貯存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋，起始濃度為128μg/mL，終末濃度為0.125μg/mL。大蒜素用RPMI-1640培養(yǎng)液將大蒜素配制成1024μg/mL的原液。再將原液用RPMI-1640培養(yǎng)液倍比稀釋使大蒜素濃度為512～4μg/mL。

1.4.3 單藥最低抑菌濃度的測(cè)定

最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)的操作方法按照CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)(M27-A方案)微量稀釋法[4]。氟康唑的藥物的濃度為128～0.125μg/mL，大蒜素為512～4μg/mL)每孔加100μL于96孔板中，再加100μL含菌培養(yǎng)液，生長(zhǎng)對(duì)照為100μL無(wú)藥培養(yǎng)液加100μL菌液，陰性對(duì)照孔為無(wú)菌無(wú)藥的培養(yǎng)液。35℃恒溫培養(yǎng)48h，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果。酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板吸光度值(A值)，與陽(yáng)性對(duì)照相比吸光度值下降50%為MIC50，與陽(yáng)性對(duì)照相比吸光度值下降90%為MIC90。大蒜素、氟康唑的最低抑菌濃度MIC50，MIC90以此為判斷結(jié)果。

1.4.4 棋盤法測(cè)定藥物的體外抗真菌作用

體外聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)采用棋盤式微量稀釋法實(shí)驗(yàn)(checkerboard microdilution assay)，取倍比稀釋的氟康唑50μL分別加入96孔板的A～H行中，取倍比稀釋的大蒜素50μL分別加入96孔板的1～8列中，藥物的濃度：大蒜素512～4μg/mL，氟康唑128～0.25μg/mL。于每孔加入100μL菌液，陽(yáng)性對(duì)照孔為100μL含菌培養(yǎng)液和100μL無(wú)藥培養(yǎng)液，陰性對(duì)照孔為無(wú)菌無(wú)藥的培養(yǎng)液200μL。35℃恒溫培養(yǎng)48h，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果。

1.4.5 芽管及菌絲抑制實(shí)驗(yàn)

將菌株接種于沙堡弱固體培養(yǎng)基上，傳代2次，以保證純種和活力，挑取菌落接種于YPD培養(yǎng)液上，35℃恒溫培養(yǎng)48h，獲取假絲酵母的孢子。調(diào)整菌液濃度至5×107CFU/mL。取10μL的菌液加入1mL含有大蒜素，氟康唑及同時(shí)含有大蒜素和氟康唑的10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中。實(shí)驗(yàn)分4組：a組：陰性對(duì)照組；b組：氟康唑16μg/mL；c組：大蒜素16μg/mL；d組：氟康唑0.5μg/mL+大蒜素4μg/mL。每組設(shè)4個(gè)平行管。恒溫35℃培養(yǎng)2h，通過(guò)顯微鏡觀察白色假絲酵母的芽管生成情況，35℃恒溫培養(yǎng)3h時(shí)，用顯微鏡觀察其芽孢和菌絲形成，拍照并保存圖片。高倍鏡下選取3～5個(gè)視野并觀察100個(gè)孢子中芽管的形成個(gè)數(shù)，并計(jì)算芽管的形成率(3倍于菌體的長(zhǎng)度為芽管)。

1.4.6 判斷標(biāo)準(zhǔn)

用分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)法(fractional inhibitory concentration index, FICI)來(lái)判定藥物聯(lián)合作用效果。∑FICI=FICA+FICB=MICA聯(lián)用/MICA單用+MICB聯(lián)用/MICB單用。FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.5～1為相加作用，1～2為無(wú)關(guān)作用，＞2為拮抗作用[5]。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPP 17.0軟件統(tǒng)計(jì)芽管生成率，組間比較采用t檢驗(yàn)。b組和d組相比，c組和d組相比，芽管生成率差異顯著(P＜0.01)。

2 結(jié)果

65株假絲酵母，對(duì)氟康唑敏感的有55株，對(duì)氟康唑耐藥的有10株，耐藥菌株包括2株白假絲酵母和7株光滑假絲酵母、1株熱帶假絲酵母。對(duì)氟康唑敏感的55株菌株對(duì)5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑均敏感，對(duì)氟康唑耐藥的菌株2株白色假絲酵母對(duì)真菌藥敏試劑盒的其它4種藥物均敏感，7株耐氟康唑的光滑假絲酵母和1株熱帶假絲酵母對(duì)真菌藥敏試劑盒的4種藥均耐藥。

2.1 單藥聯(lián)合用藥的MIC變化

大蒜素與氟康唑單用和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)敏感和耐藥假絲酵母的MIC見表1。聯(lián)合用藥較單一用大蒜素及氟康唑的MIC50和MIC90均有明顯降低。聯(lián)合用藥對(duì)假絲酵母的敏感菌株和耐藥菌株的MIC50氟康唑降低8倍、大蒜素降低5倍(分別為由32μg/mL降至0.25μg/mL、由32μg/mL降至2μg/mL)。

2.2 FICI值

65株菌株FICI≤0.5占100%，表現(xiàn)為協(xié)同作用

2.3 大蒜素作用下芽管形成率和菌絲抑制

分為4個(gè)組：分別為a組：陰性對(duì)照組；b組：氟康唑16μg/mL；c組：大蒜素16μg/mL；d組：氟康唑0.5μg/mL+大蒜素4μg/mL。b組和d組相比，c組和d組相比，芽管生成率差異顯著(P＜0.01)。兩藥聯(lián)合時(shí)，芽管生成率較單藥應(yīng)用時(shí)顯著下降，大蒜素可以加強(qiáng)氟康唑的芽管抑制能力(圖1)；圖2顯示不同藥物濃度作用3h芽管形成的情況，陰性組可見大量菌絲形成，氟康唑和大蒜素組雖可見菌絲抑制，但還有一定量的菌絲生長(zhǎng)，聯(lián)合組菌絲生長(zhǎng)明顯受到抑制，說(shuō)明大蒜素能加強(qiáng)氟康唑抑制菌絲生成的能力。

表 1 大蒜素與氟康唑聯(lián)用對(duì)敏感和耐藥假絲酵母MIC/(μg/mL)Tab.1 Garlicin combined with fluconazole against sensitive and resistant Candida MIC/(μg/mL)

3 討論

圖1 不同組抗生素作用3h芽管生成率 Fig.1 Germ tube formation rate after 3h of antibiotic treatment in different groups

圖2 不同組抗生素作用3h顯微鏡下芽管形成密度Fig.2 The density of hyphae under different groups of antibiotics for 3h

近年來(lái)，深部真菌感染逐年上升，尤其以白假絲酵母感染最為多見[6]。臨床上常見的抗真菌藥物氟康唑存在抗菌譜窄、價(jià)格昂貴、耐藥性嚴(yán)重及不同程度毒副作用等問(wèn)題[7-8]。如何合理應(yīng)用抗真菌藥物并減輕其毒副作用和耐藥性是臨床中極具挑戰(zhàn)性的課題。目前抗真菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用常局限于少數(shù)抗真菌藥物之間的聯(lián)合應(yīng)用。中藥作為祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥有著幾千年的發(fā)展歷史，在治療疾病方面有著天然的優(yōu)勢(shì)，具有取材方便，毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中的大蒜素是大蒜中的主要成分，其主要作用機(jī)制是能與含有巰基的酶相互作用，不可逆地抑制巰基蛋白酶而發(fā)揮抗菌活性[9]；大蒜素的抗細(xì)菌活性研究顯示其對(duì)常見的銅綠假單胞菌有較好的抗菌作用[10]， 甚至可通過(guò)細(xì)菌體內(nèi)氧化失衡而抑制多重耐藥的耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌，并與碳青霉烯類抗菌藥物具有協(xié)同殺菌效應(yīng)[11]。大蒜素應(yīng)用于臨床抗感染治療也取得較好的效果，聯(lián)合抗菌藥物能顯著提高單藥的抗菌作用，有報(bào)道大蒜素聯(lián)合制霉菌素治療鵝口瘡可顯著提高有效率，降低復(fù)發(fā)率[12]；聯(lián)合抗菌藥治療細(xì)菌感染所致呼吸機(jī)有關(guān)的肺炎時(shí)能顯著縮短抗生素使用時(shí)間及ICU住院時(shí)間，降低不良反應(yīng)的產(chǎn)生[13]。但大蒜素聯(lián)合抗真菌研究很少，本研究選取了臨床標(biāo)本分離的白色假絲酵母、光滑假絲酵母等常見的假絲酵母菌株以微量稀釋法和棋盤式微量稀釋法初步確定了大蒜素抗假絲酵母和大蒜素與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用的抗假絲酵母作用效果，結(jié)果顯示大蒜素與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，MIC50及MIC90均降低，證實(shí)了大蒜素可增強(qiáng)氟康唑的抗菌活性，具有完全協(xié)同作用。真菌作為真核細(xì)胞微生物，其有典型的細(xì)胞核，以寄生或腐生的方式生存，由單細(xì)胞或多細(xì)胞組成。多細(xì)胞類真菌主要由假絲和孢子組成，假絲形成是致病的關(guān)鍵因子。本研究觀察氟康唑、大蒜素及兩藥聯(lián)合抑制小牛血清誘導(dǎo)假絲酵母假絲及芽管的形成作用，證實(shí)大蒜素可以增強(qiáng)氟康唑的抑制假絲效果，假絲形成和芽管形成率均明顯降低，且減少單藥的用藥濃度進(jìn)而減少不良反應(yīng)。本研究為臨床的大蒜素聯(lián)合抗真菌治療提供了依據(jù)。