宮 強(qiáng)，郭潔真，杜珍奇，阮夢(mèng)蝶，牛明福，秦翠麗

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471023)

銅綠假單胞菌廣泛存在于水、土壤、塵埃、植物、動(dòng)物和人體的會(huì)陰、腋窩、耳蝸等處，屬于人畜共患的條件性致病菌，感染人后可引起肺炎、泌尿系感染、腦膜炎等疾病，尤其是該菌導(dǎo)致的肺部感染，患者病死率較高，成為臨床肺部感染的一大難題。此外，水貂、禽類等多種動(dòng)物也會(huì)感染該菌，給養(yǎng)殖業(yè)帶來一定的損失。目前對(duì)于該菌的治療仍然主要依賴于抗生素，但近年來關(guān)于銅綠假單胞菌耐藥性的報(bào)道屢見不鮮，且呈現(xiàn)廣譜耐藥性，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[1]。

對(duì)于細(xì)菌類疾病的控制，除應(yīng)用抗菌藥物外，疫苗免疫不失為有效的手段之一。對(duì)銅綠假單胞菌疫苗的研究報(bào)道雖然不在少數(shù)，然而目前在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上均無可用的商品化疫苗，因此，研制針對(duì)該菌的新型有效疫苗迫在眉睫。DNA 疫苗因具有制備方便、成本較低等優(yōu)點(diǎn)而廣受關(guān)注，但細(xì)菌DNA 疫苗的免疫效果普遍不及傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗，如何提高DNA 疫苗的保護(hù)效果已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)之一，常用的策略包括優(yōu)化接種方式、使用新型疫苗佐劑等。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了銅綠假單胞菌鞭毛蛋白flgE基因的DNA 疫苗，以天然多糖菊粉為佐劑，免疫小鼠檢測了其誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平及攻毒保護(hù)效果，旨在為銅綠假單胞菌病DNA 疫苗及DNA疫苗新型佐劑的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與菌種 6 周齡～8 周齡BALB/c 小鼠購自河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院；銅綠假單胞菌、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 菊粉為Sigma 公司產(chǎn)品(批號(hào)225596T)；羊抗小鼠IgG-HRP 購自諾唯贊生物科技公司；BamHⅠ和EcoRⅠ購自賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；MTT 購自北京鼎國昌盛生物公司；小鼠IFN-γ ELISA 試劑盒購自嘉美生物技術(shù)公司；真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GeneBank 中銅綠假單胞菌的flgE基因設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增該基因的引物(PU：5'-ACTGGATCCATGAGTTTCAACATCGGCCT GAGCG-3'/PL： 5'-GCGAATTCTCAGCGCAGGTTGA TGATGGTCTGG-3')，上下游引物序列分別含有BamHⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)，以常規(guī)方法提取的銅綠假單胞菌基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增flgE基因，回收純化后以和BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切后克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，以上述兩種限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定，獲得的陽性重組質(zhì)粒即為含銅綠假單胞菌flgE基因的DNA 疫苗，命名為pcE。

1.4 滅活疫苗和菌毛蛋白疫苗的制備 制備銅綠假單胞菌懸液并調(diào)整其濃度為2×1010cfu/mL，經(jīng)甲醛滅活后，加入總體積6 %的吐溫-80 攪拌均勻后作為水相，以94 %的白油、6 %的司盤80 和2 %的硬脂酸鋁作為油相，水相和油相按照1:2 的比例混合充分乳化制備銅綠假單胞菌滅活疫苗。向銅綠假單胞菌的菌體沉淀中加入1 mol/L 鹽酸調(diào)整pH 值至2.0，室溫磁力攪拌裂解細(xì)菌后離心收集上清液，并以NaOH 調(diào)整pH 值為7.2 后以硫酸銨沉淀法獲得菌毛蛋白。測定并調(diào)整蛋白濃度后按照上述方式將水相和油相1:2 乳化制備銅綠假單胞菌菌毛蛋白疫苗，使疫苗中蛋白含量為1 μg/μL。

1.5 動(dòng)物免疫 將6 周齡～8 周齡BALB/c 小鼠共140 只，隨機(jī)平均分為7 組，分別為pcE 組(即DNA疫苗組)、菊粉灌胃組、菊粉佐劑組、滅活疫苗組、鞭毛蛋白組、pcDNA3.1(+)空載體組和PBS 陰性對(duì)照組。菊粉灌胃組以600 mg/kg 的劑量灌胃菊粉，連續(xù)灌胃20 d，期間其它各組正常飼養(yǎng)，灌胃結(jié)束后對(duì)各組小鼠進(jìn)行免疫。DNA 疫苗組和菊粉灌胃組以100 μg/ 只的劑量免疫pcE 質(zhì)粒；pcDNA3.1(+)組每只注射100 μg 空載體質(zhì)粒；菊粉佐劑組為pcE 質(zhì)粒中添加菊粉，使其終濃度為20 %，充分混勻溶解后以100 μg/ 只的劑量免疫小鼠；陰性對(duì)照組的小鼠，每只肌肉注射100 μL 1×PBS。上述各組均采用腿部肌肉注射。滅活疫苗與鞭毛蛋白疫苗注射于小鼠背部皮下，每只100 μL。以上各組均免疫3 次，每次間隔兩周。具體分組及免疫成份見表1。

表1 動(dòng)物分組Table 1 Animal groups

1.6 抗體水平檢測 參照文獻(xiàn)[2]間接ELISA 方法，免疫后每周采血至攻毒前，分離血清，分別以2×109cfu/mL 的銅綠假單胞菌菌體和20 μg/mL 的鞭毛蛋白為包被抗原包被酶標(biāo)板，以待檢血清(1∶100)為一抗， 羊抗小鼠IgG-HRP (1∶2 000)為二抗，測定免疫小鼠的血清抗體水平。

1.7 脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 分別于每次免疫后兩周時(shí)各取兩只小鼠脫頸迫殺，無菌采集脾臟制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，采用MTT法測定各組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖水平。

1.8 脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 水平的檢測 每次免疫后兩周時(shí)分離并制備各組小鼠脾淋巴細(xì)胞，37 ℃5 %的CO2孵育72 h 后，吸取培養(yǎng)液，離心收集上清，利用小鼠IFN-γ 檢測試劑盒，分別對(duì)免疫小鼠脾細(xì)胞分泌的IFN-γ 水平進(jìn)行檢測。

1.9 動(dòng)物攻毒試驗(yàn) 第3 次免疫兩周后，各組小鼠以1.35×1010cfu/ 只腹腔注射銅綠假單胞菌進(jìn)行攻毒，攻毒后繼續(xù)飼養(yǎng)觀察兩周，記錄各組小鼠的存活數(shù)，計(jì)算疫苗的保護(hù)率。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 以銅綠假單胞菌基因組為模板，采用特異性引物對(duì)flgE基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增得到約1 400 bp 的目的條帶，與預(yù)期大小一致(圖1A)，表明擴(kuò)增得到flgE基因。隨后將目的基因克隆于真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcE，并以BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，經(jīng)雙酶切獲得約1 400 bp 的DNA 片段，與預(yù)期大小一致(圖1B)，表明重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。

圖1 flgE 基因的PCR 擴(kuò)增(A)及重組質(zhì)粒pcE 的雙酶切鑒定(B)Fig.1 PCR amplification of flgE gene (A)and electrophoresis of the two enzymes digestion of pcE (B)

2.2 小鼠抗體檢測結(jié)果 免疫后每周采血分離血清，分別以銅綠假單胞菌全菌體及鞭毛蛋白為包被抗原，利用間接ELISA 檢測各組小鼠的血清抗體水平，結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，除空載體組和PBS 組外，其它各疫苗組小鼠的血清抗體水平均呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。以全菌體為包被抗原時(shí)檢測到的滅活疫苗組的抗體水平略高于鞭毛蛋白組，而以鞭毛蛋白為包被抗原時(shí)檢測到的抗體水平則反之。以兩種包被抗原檢測到的菊粉灌胃組、菊粉佐劑組和DNA 疫苗組的血清抗體水平始終無明顯差異(p＜0.05)，但均顯著低于滅活疫苗組和鞭毛蛋白組(p＞0.05)(圖2)。表明菊粉為佐劑和菊粉預(yù)先灌胃均對(duì)flgE基因DNA 疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平無明顯促進(jìn)作用。

2.3 小鼠淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果 每次免疫2 周后，制備免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，以銅綠假單胞菌的鞭毛蛋白刺激后進(jìn)行MTT 法檢測，結(jié)果顯示，一免后各疫苗組之間的SI 值無明顯差異(p＞0.05)；二免和三免后滅活疫苗組的SI 值顯著高于鞭毛蛋白組和菊粉佐劑組(p＜0.05)，極顯著高于菊粉灌胃組和DNA 疫苗組(p＜0.01)，且鞭毛蛋白組和菊粉佐劑組的SI 值顯著高于菊粉灌胃組和DNA 疫苗組(p＜0.05)，但鞭毛蛋白組和菊粉佐劑組之間則無顯著差異(p＞0.05)(圖3)。表明菊粉為佐劑可在一定程度上提高flgE基因DNA 疫苗誘導(dǎo)的免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖水平。

圖2 免疫小鼠血清中抗體水平檢測結(jié)果Fig.2 The levels of serum antibodies in immunized mice

圖3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況Fig.3 The splenic lymphocytes proliferation in immunized mice

2.4 小鼠IFN-γ 分泌水平的檢測結(jié)果 每次免疫2 周后，制備各組小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液，收集上清后檢測IFN-γ 的分泌量。結(jié)果與淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)類似，一免后，各疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ 的量無明顯差異(p＞0.05)；二免和三免后，滅活疫苗組IFN-γ 的分泌量明顯高于鞭毛蛋白組和菊粉佐劑組(p＜0.05)，極顯著高于DNA 疫苗組和菊粉灌胃組(p＜0.01)，且前兩者高于后兩者(p＜0.05)(圖4)。表明菊粉作為佐劑可以增強(qiáng)flgE基因DNA 疫苗誘導(dǎo)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 的能力。

圖4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 的水平Fig.4 The levels of IFN-γ in splenic lymphocytes of immunized mice

2.5 攻毒試驗(yàn)結(jié)果 各組小鼠于第3 次免疫后兩周時(shí)以銅綠假單胞菌攻毒，繼續(xù)飼養(yǎng)觀察兩周。攻毒結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)組和PBS 對(duì)照組的小鼠全部死亡；滅活疫苗組小鼠無一死亡，保護(hù)率最高；菊粉佐劑組和鞭毛蛋白組保護(hù)率相當(dāng)，高于菊粉灌胃組和DNA 疫苗組；且菊粉灌胃組的保護(hù)率高于DNA 疫苗組(表2)。表明菊粉作為佐劑和預(yù)先灌胃均可以提高flgE基因DNA 疫苗為小鼠提供的保護(hù)效果，且以菊粉作為佐劑時(shí)效果更優(yōu)。

表2 動(dòng)物攻毒試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Protection of immunized mice against lethal challenge with Pseudomonas aeruginosa

3 討 論

目前臨床上尚無針對(duì)銅綠假單胞菌的可用疫苗，但對(duì)其疫苗的研究報(bào)道不在少數(shù)，包括DNA疫苗、亞單位疫苗、滅活疫苗等均有相關(guān)研究[3-5]。本實(shí)驗(yàn)以銅綠假單胞菌的flgE基因構(gòu)建了DNA 疫苗，檢測了該DNA 疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫效果。flgE是銅綠假單胞菌的鞭毛蛋白編碼基因，是重要的保護(hù)性抗原基因之一。研究表明，多種病原菌的鞭毛蛋白均具有較好的免疫原性，可用于相關(guān)疫苗的研究[6-8]。林丹丹等在大腸桿菌中表達(dá)純化了銅綠假單胞菌的鞭毛蛋白，并在人角膜上皮細(xì)胞中檢測了其活性[9]。Weimer 等的研究顯示，銅綠假單胞菌的鞭毛蛋白可以增強(qiáng)OPRF/OPRI 表位疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用[10-11]。雖然目前對(duì)銅綠假單胞菌DNA 疫苗的研究較為多見，但以flgE基因構(gòu)建DNA 疫苗的報(bào)道則相對(duì)較少。本課題組前期以銅綠假單胞菌的oprL和oprF基因構(gòu)建了單價(jià)和融合DNA 疫苗，但結(jié)果顯示其免疫效果仍難以超越滅活疫苗[12-13]。因此需要采取一定的措施進(jìn)一步增強(qiáng)DNA 疫苗的免疫原性，如選擇更加有效的抗原基因，采用疫苗佐劑等。

菊粉是一類天然的植物多糖，在體內(nèi)可以被代謝成簡單的果糖和葡萄糖，因此不會(huì)伴隨有任何局部或全身的毒性，對(duì)人和動(dòng)物來說都是一種安全的免疫佐劑[14]。研究顯示菊粉對(duì)乙肝疫苗、李氏桿菌疫苗、流感疫苗等均有一定的免疫增強(qiáng)作用[15-17]。本課題組前期的研究也顯示，以菊粉灌胃小鼠后可以提高小鼠的免疫器官指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、血清溶血素水平、脾淋巴細(xì)胞增殖水平和IFN-γ 分泌水平[18]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)對(duì)菊粉預(yù)先灌胃和菊粉作為佐劑時(shí)對(duì)銅綠假單胞菌flgE基因DNA 疫苗的免疫增強(qiáng)作用進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，無論以菊粉灌胃還是以菊粉為佐劑，對(duì)flgE基因DNA 疫苗誘導(dǎo)的血清抗體水平均無顯著的促進(jìn)作用，表明菊粉不能提高該DNA 疫苗誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的能力。然而淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和IFN-γ 分泌試驗(yàn)結(jié)果則顯示，菊粉佐劑組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力和IFN-γ 分泌水平均明顯優(yōu)于DNA 疫苗組和菊粉灌胃組，表明菊粉為佐劑可在一定程度上增強(qiáng)flgE基因DNA 疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，但菊粉預(yù)先灌胃則無此作用。攻毒試驗(yàn)結(jié)果也表明菊粉作為佐劑可提高flgE基因DNA 疫苗的保護(hù)效果，雖然菊粉預(yù)先灌胃對(duì)該DNA 疫苗誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平均無明顯影響，但仍可在一定程度上提高其為小鼠提供的免疫保護(hù)效果，其原因需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。