高俊峰，高忠燕，王麗坤，張顯光，崔宇超，侯美如

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾161005；2.扎龍國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，黑龍江齊齊哈爾161002)

枝雙腔吸蟲(chóng)(Dicrocoelium dendriticum)屬于雙腔科(Dicrocoeliidae)雙腔屬(Dicrocoelium)，是一種食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病原，主要寄生于終末宿主的膽囊和膽管，引起雙腔吸蟲(chóng)病，宿主呈漸進(jìn)性消瘦和消化不良，進(jìn)而造成肉和奶的產(chǎn)量下降以及幼畜的死亡[1]。枝雙腔吸蟲(chóng)的終末宿主范圍比較廣泛，主要感染牛和羊，此外，兔子、貓、狗、豬、馬和人也可感染，一些野生動(dòng)物如鹿、駱駝、羊駝也有感染枝雙腔吸蟲(chóng)的報(bào)道[2-3]。因此，枝雙腔吸蟲(chóng)不僅給畜牧產(chǎn)業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)人類和野生動(dòng)物的生命健康也具有一定的威脅。

國(guó)內(nèi)關(guān)于枝雙腔吸蟲(chóng)的報(bào)道極少，僅在青海高原[4]和黑龍江省牡丹江地區(qū)[5]有枝雙腔吸蟲(chóng)的報(bào)道，而且主要集中于流行病學(xué)調(diào)查和形態(tài)學(xué)鑒定，這可能與形態(tài)學(xué)鑒定困難，容易造成誤判有關(guān)。雙腔吸蟲(chóng)屬的枝雙腔吸蟲(chóng)、中華雙腔吸蟲(chóng)和矛形雙腔吸蟲(chóng)在形態(tài)學(xué)上較為相似，并且均可以感染羊[6]，這給鑒別檢測(cè)帶來(lái)了一定的難度。核糖體DNA (rDNA)作為一個(gè)實(shí)用的分類工具，能夠顯示出不同寄生蟲(chóng)之間的種內(nèi)差異和種間差異，其中，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer region，ITS)序列可作為較好的基因標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)的遺傳進(jìn)化分析[7]。因此，本研究擬對(duì)齊齊哈爾地區(qū)綿羊膽管中分離的吸蟲(chóng)通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，并基于ITS-2 序列進(jìn)行分子進(jìn)化研究，為雙腔吸蟲(chóng)的流行病學(xué)調(diào)查和分子鑒別診斷提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng) 體 2017 年8 月，于黑龍江省齊齊哈爾市周邊某羊場(chǎng)剖檢病死成年綿羊，于膽管中收集到大量新鮮蟲(chóng)體，經(jīng)生理鹽水沖洗后，保存于70 %乙醇中固定備用。

1.2 主要試劑 蘇木素染液購(gòu)自Biosharp 公司；Tissue DNA Kit 購(gòu)自O(shè)MEGA bio-tek 公司；ExTaqDNA 聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker、pMD18-T 載體均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.3 吸蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定 采用蘇木素染色法[8]將乙醇固定的蟲(chóng)體染色后制作成裝片，于顯微鏡下觀察，記錄蟲(chóng)體形態(tài)，根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定要點(diǎn)進(jìn)行鑒定。

1.4 rDNA ITS 基因序列的PCR 擴(kuò)增及分析 取5條成蟲(chóng)樣品，分別置于無(wú)菌離心管中，利用DNA提取試劑盒提取蟲(chóng)體總DNA，提取的DNA 樣品放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以提取的DNA 為模板，利用通用引物NC5：5'-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3'/NC2：5'-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3'，PCR 擴(kuò)增ITS 基因序列。反應(yīng)體系為25 μL；反應(yīng)條件為：92 ℃2 min；92 ℃30 s、50 ℃30 s、72 ℃1 min 20 s，共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化回收。純化后連接于pMD18-T 載體中，轉(zhuǎn)化至DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，篩選陽(yáng)性重組菌，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR 鑒定后，陽(yáng)性質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司雙向測(cè)序。利用生物學(xué)軟件DNAStar，參照NCBI 中相關(guān)吸蟲(chóng)ITS 序列，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，確定ITS 各段的大小，將ITS-1 和ITS-2 序列拼接，與NCBI 中同源性最高的吸蟲(chóng)ITS 序列進(jìn)行比對(duì)分析。

將獲得吸蟲(chóng)的ITS-2 基因序列與NCBI 中相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)分析，以斜睪目背孔科背孔屬Notocotylus malhamensis(JQ766940)作為外群，利用Clustal X 1.83 和MEGA 5.1 軟件繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，探究本研究分離吸蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)生位置。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定 采用蘇木素染色法將蟲(chóng)體染色后制作成裝片經(jīng)顯微鏡觀察，結(jié)果顯示本研究的蟲(chóng)體形態(tài)與文獻(xiàn)[6]中枝雙腔吸蟲(chóng)的描述一致，蟲(chóng)體呈肩紡錘形。有口、腹吸盤(pán)，從腹吸盤(pán)到蟲(chóng)體后端，蟲(chóng)體的寬度幾乎一致。兩睪丸在腹吸盤(pán)后呈斜列排布，睪丸分瓣，從睪丸引出的小輸精管在腹吸盤(pán)上會(huì)合后伸進(jìn)陰莖囊，陰莖囊大而發(fā)達(dá)，與子宮末端共同開(kāi)口于腸分叉處后方。卵巢位于睪丸后方，成塊狀。兩束卵黃腺呈細(xì)枝條狀，分布于蟲(chóng)體兩側(cè)。子宮較為發(fā)達(dá)，由許多上行和下行的子宮圈組成，幾乎充滿生殖腺與腸管之間的全部縫隙(圖1)。該結(jié)果表明本研究分離的吸蟲(chóng)在形態(tài)學(xué)上鑒定為枝雙腔吸蟲(chóng)。

枝雙腔吸蟲(chóng)與中華雙腔吸蟲(chóng)、矛形雙腔吸蟲(chóng)同屬于雙腔科雙腔屬，終末宿主主要為反芻動(dòng)物。它們?cè)谛螒B(tài)學(xué)上較為相似，唐崇惕等[6]描述3 種雙腔吸蟲(chóng)形態(tài)和睪丸的排列方式存在差異，枝雙腔吸蟲(chóng)蟲(chóng)體形態(tài)呈紡錘形或橢圓形，睪丸呈分支斜列；中華雙腔吸蟲(chóng)蟲(chóng)體形態(tài)呈紡錘形，睪丸呈并列狀；矛形雙腔吸蟲(chóng)蟲(chóng)體呈長(zhǎng)矛形，睪丸呈團(tuán)塊狀前后排列。本研究分離的雙腔吸蟲(chóng)參照以上鑒定要點(diǎn)初步鑒定為枝雙腔吸蟲(chóng)。然而，Otranto 等報(bào)道的枝雙腔吸蟲(chóng)蟲(chóng)體呈長(zhǎng)矛形，睪丸排列方式為前后排列，分子生物學(xué)鑒定同樣為枝雙腔吸蟲(chóng)[9]；Fakhar 等報(bào)道的枝雙腔吸蟲(chóng)蟲(chóng)體呈紡錘形，睪丸為前后排列[10]。蟲(chóng)體的形態(tài)可能受諸多因素影響，如：蟲(chóng)體的壽命、營(yíng)養(yǎng)條件、感染程度、地理分布、不同的發(fā)育階段、檢測(cè)方法、時(shí)間和地點(diǎn)等，因此，僅憑傳統(tǒng)方法鑒定形態(tài)上相似的吸蟲(chóng)有一定的困難，為更確切了解本研究分離吸蟲(chóng)的分類地位，需要從分子水平上做進(jìn)一步鑒定。

圖1 枝雙腔吸蟲(chóng)形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphology of the trematode isolated in this study

2.2 rDNA ITS 基因序列的擴(kuò)增及分析 利用通用引物擴(kuò)增5 條吸蟲(chóng)的rDNA ITS 序列，產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增的條帶均出現(xiàn)在約1 000 bp 的位置，與預(yù)期目的片段一致，且無(wú)非特異性條帶。基因片段經(jīng)測(cè)序后經(jīng)人工校正，得到完整的ITS 序列，5 條蟲(chóng)體的ITS 序列完全一致，全長(zhǎng)為1 144 bp，通過(guò)與NCBI 中其它ITS 基因序列比對(duì)分析得出ITS-1，5.8s 和ITS-2 大小分別為749 bp，161 bp 和234 bp。將獲得的ITS-1 和ITS-2 基因序列拼接后與NCBI 中枝雙腔吸蟲(chóng)(KC774522)的ITS-1 和ITS-2 拼接序列進(jìn)行比對(duì)分析，二者同源性可達(dá)99.8 %，ITS 全基因序列中存在兩處突變，分別為ITS-1 區(qū)域的C87T 和ITS-2 區(qū)域的A763G。該結(jié)果表明本研究分離的吸蟲(chóng)在分子水平上也鑒定為枝雙腔吸蟲(chóng)。

2.3 雙腔科吸蟲(chóng)系統(tǒng)進(jìn)化分析 本研究利用ITS-2基因序列作為基因標(biāo)記構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Notocotylus malhamensis作為外群，與雙腔科吸蟲(chóng)明顯處于兩個(gè)不同的分支。本研究分離的吸蟲(chóng)與枝雙腔吸蟲(chóng)聚集在一起，種內(nèi)差異率為0～0.9 %。所有的枝雙腔吸蟲(chóng)與雙腔屬的另外兩種吸蟲(chóng)中華雙腔吸蟲(chóng)、東方雙腔吸蟲(chóng)聚集在一個(gè)大分支里，而與同為雙腔屬的牛雙腔吸蟲(chóng)遺傳距離稍遠(yuǎn)，本研究分離的吸蟲(chóng)與雙腔屬的其它吸蟲(chóng)種間差異率為3.4 %～11.4 %，種間差異明顯大于種內(nèi)差異。雙腔屬、短腺屬和饒氏屬的吸蟲(chóng)聚集在一個(gè)更大分支內(nèi)，扁體屬和闊盤(pán)屬聚集在另一個(gè)大分支內(nèi)，本研究分離的吸蟲(chóng)與雙腔科其它屬吸蟲(chóng)差異率為6.9 %～23.1 %，差異更為明顯(圖2)。這表明ITS-2 基因序列種內(nèi)變異很小，種間差異明顯，ITS-2 也適合作為吸蟲(chóng)的遺傳標(biāo)尺。

本研究進(jìn)化樹(shù)選擇來(lái)自于不同地區(qū)和不同宿主的枝雙腔吸蟲(chóng)的ITS-2 基因序列，地域上主要為歐洲和亞洲地區(qū)，宿主包括家養(yǎng)動(dòng)物和野生動(dòng)物，進(jìn)化樹(shù)顯示不同來(lái)源的ITS-2 基因序列差異不大，可能是因?yàn)橹﹄p腔吸蟲(chóng)種群內(nèi)存在基因穩(wěn)定性，這種基因穩(wěn)定性已被證明存在于其它同樣是宿主和地域來(lái)源均廣泛的寄生蟲(chóng)種群內(nèi)[11]。中華雙腔吸蟲(chóng)和東方雙腔吸蟲(chóng)聚集在一個(gè)小分支中，這與Bian[1]等的報(bào)道結(jié)果相一致，表明這兩種吸蟲(chóng)很可能為同一個(gè)種。而雙腔屬中牛雙腔吸蟲(chóng)與其它吸蟲(chóng)遺傳距離稍遠(yuǎn)，與短腺屬分離自歐亞鴝的吸蟲(chóng)處于同一個(gè)分支，雖然牛雙腔吸蟲(chóng)宿主來(lái)源也為反芻動(dòng)物，但依據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和宿主進(jìn)行種屬分類可能存在一定的缺陷，由于數(shù)據(jù)有限，這一推斷還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過(guò)對(duì)黑龍江省齊齊哈爾地區(qū)綿羊體內(nèi)分離的吸蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，最終確定所分離的吸蟲(chóng)為枝雙腔吸蟲(chóng)，該結(jié)果為齊齊哈爾地區(qū)雙腔吸蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查及分子鑒別診斷提供科學(xué)的參考依據(jù)。

圖2 分離的雙腔科吸蟲(chóng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Dicrocoeliidae trematode